Дерябина органическая химия: Дерябина Н.Е. Органическая химия. Учебник-тетрадь — ХИМБУК.РУ

Адам Нельсон

^a Школа химии, Университет Лидса, Лидс LS2 9JT, Великобритания

^b Центр молекулярных структур Astbury для Биология, Университет Лидса, Лидс LS2 9JT, Великобритания

^a Школа химии, Университет Лидса, Лидс LS2 9JT, Великобритания

^b Центр структурной молекулярной биологии Эстбери, Университет Лидса, Лидс LS2 9JT, Великобритания

Получено 7 декабря 2007 г .; Пересмотрено 3 января 2008 г.

Abstract

Этот обзор посвящен направленной эволюции альдолаз с синтетически полезными свойствами. Направленная эволюция использовалась для устранения ряда ограничений, связанных с использованием альдолаз дикого типа в качестве катализаторов в синтетической органической химии.Описано получение ферментов альдолазы с модифицированным или расширенным репертуаром субстратов. Особое внимание уделяется направленной эволюции альдолаз с модифицированными стереохимическими свойствами: такие ферменты могут быть полезными катализаторами стереоселективного синтеза биологически активных малых молекул. В обзоре также описаны некоторые фундаментальные идеи механистической энзимологии, которые может дать направленная эволюция.

Ключевые слова: Направленная эволюция, альдолазы, специфичность субстрата, стереохимия, органический синтез, образование углерод-углеродной связи

Альдольная реакция является краеугольным камнем современной синтетической органической химии [1–4].Реакция приводит к образованию новой углерод-углеродной связи и до двух новых стереогенных центров. Таким образом, альдольная реакция чрезвычайно широко использовалась в стереоконтролируемом синтезе природных продуктов и других сложных биоактивных малых молекул [5]. Для асимметричной альдольной реакции разработан широкий спектр катализаторов, включая небольшие органические молекулы [6–12] (органокатализаторы) и координационные комплексы основных групп и переходных металлов, несущие хиральные лиганды [13–17]. Кроме того, класс ферментов – альдолазы – катализируют асимметричную альдольную реакцию [18–20].

Хотя некоторые ферменты с интересной альдолазной активностью были получены путем рациональной модернизации [21,22], этот обзор будет сосредоточен на направленной эволюции альдолаз [23] посредством оценки библиотек вариантных ферментов. Мы не описали интересных примеров направленной эволюции альдолаз, не имеющих очевидного потенциала для применения в синтетической химии [24]. Многие полезные методы, которые были разработаны для создания библиотек мутантных белков, были подробно рассмотрены в других местах [25–27].

Направленная эволюция использовалась для устранения ряда ограничений, связанных с использованием альдолаз дикого типа в качестве катализаторов в синтетической органической химии. Описано получение ферментов альдолазы с модифицированным или расширенным репертуаром субстратов. Кроме того, описана направленная эволюция альдолаз с измененными стереохимическими свойствами; такие ферменты могут способствовать синтезу альтернативных стереоизомерных продуктов. В этом обзоре субстраты и продукты реакций, катализируемых альдолазой, представлены в форме с открытой цепью, чтобы подчеркнуть каталитические различия между ферментами дикого типа и развитыми ферментами.Однако направленная эволюция альдолаз с улучшенной термической стабильностью или толерантностью к органическим растворителям выходит за рамки обзора [28].

Существует два класса ферментов альдолазы – класс I и класс II, которые классифицируются в соответствии с их каталитическим механизмом (). Альдолазы класса I имеют каталитический остаток лизина, который реагирует с донорным субстратом с образованием промежуточного енамина [29–33]. Нуклеофильный енамин атакует акцепторный субстрат, приводя к образованию новой углерод-углеродной связи; гидролиз полученного имина дает альдольный продукт.Напротив, альдолазы класса II содержат каталитический ион цинка, который способствует енолизации донорного субстрата [34–37]; Полученный промежуточный продукт енолята цинка атакует акцепторный субстрат с прямым выходом альдольного продукта. В обоих случаях образование новой углерод-углеродной связи приводит к созданию до двух новых стереогенных центров. Конфигурация нового стереогенного центра (ов) зависит от того, какая сторона акцептора альдегида и, в некоторых случаях, какая сторона нуклеофильного промежуточного соединения вступает в реакцию.Некоторые ферменты альдолазы обладают точным контролем над стереохимическим ходом образования углерод-углеродной связи, что приводит к образованию альдольных продуктов с высокой стереоселективностью.

Ключевые различия между механизмами альдолаз класса I и класса II, проиллюстрированные для двух классов альдолаз фруктозо-1,6-бисфосфат (FBP), которые катализируют конденсацию между донором, дигидроксиацетонфосфатом (DHAP), и акцептором, глицеральдегидом 3-фосфат. (A) В альдолазе I класса мышц кролика (RAMA) Lys-229 участвует в образовании основания Шиффа с DHAP, которое атакует карбонильную группу глицеральдегид-3-фосфата [29–33].(B) В FBP-альдолазе E. coli класса II донорный DHAP енолизируется Glu-182, и образующийся промежуточный эндиолят атакует акцепторный субстрат [34–37].

Ключевым компонентом любого эксперимента направленной эволюции является надежный высокопроизводительный метод идентификации вариантных белков с требуемыми свойствами. Это может быть достигнуто путем скрининга или отбора. Скрининг включает использование высокопроизводительного анализа для выявления мутантов, которые катализируют требуемую реакцию.Напротив, при использовании отбора бактерии могут выжить, только если они экспрессируют мутантный белок с необходимыми каталитическими свойствами.

Высокопроизводительные методы отбора позволяют оценивать большие библиотеки вариантных альдолаз. Вариант 2-кето-3-дезокси-6-фосфогалактонат (KDPGal) альдолазы, который катализирует образование альтернативного продукта, 3-дезокси-d-арабиногептулозы (DAHP) ¹ , был идентифицирован с использованием DAHP-синтазы-дефицитной штамм E. coli [38,39].К сожалению, этот общий подход не может быть использован для идентификации альдолаз, которые катализируют синтез многих интересных продуктов, лежащих за пределами компетенции метаболизма. В одном из таких случаев для анализа производства альтернативного продукта использовался скрининг с использованием высокопроизводительной газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) [40].

Во многих случаях легче отсеивать или выбирать для катализа альдольную реакцию в обратном направлении. Этот подход основан на принципе микроскопической обратимости: альдолазы, которые катализируют ретроальдольную реакцию, должны также катализировать соответствующую синтетически полезную альдольную конденсацию.Этот подход ценен, когда одним из продуктов ретроальдольной реакции является обычный метаболит, такой как пируват [41–46] или глицеральдегид-3-фосфат [47]. Затем ферменты с требуемой активностью часто можно идентифицировать с помощью скрининга, основанного на анализе сопряженных ферментов. Кроме того, был разработан скрининговый анализ, в котором продукт реакции, катализируемой трансальдолазой, может спонтанно высвобождать флуорофор [48].

Методы селекции in vivo иногда также можно использовать для идентификации катализаторов обратных альдольных реакций.Например, в одной программе направленной эволюции бактерии были отобраны на основе способности использовать l-рамнозу в качестве единственного источника углерода: такие бактерии были способны выживать за счет экспрессии вариантной альдолазы, способной расщеплять l-рамнулозу [49] . Аналогичным образом, выделенные альдолазы, способные катализировать ретроальдольные реакции с образованием пирувата, были отобраны с использованием дефицитной пируваткиназы Escherichia coli [50].

Направленная эволюция альдолаз с измененной субстратной специфичностью

Направленная эволюция – это мощный подход, который позволяет создавать белки с новыми или улучшенными свойствами.Процесс является итеративным, и белки с измененными свойствами, требуемыми исследователем, могут быть использованы в последующих циклах эволюции. Этот подход был использован для создания ферментов с новыми синтетически полезными свойствами. Одним из ограничений ферментов в качестве катализаторов синтетической химии является то, что ферменты дикого типа часто принимают только ограниченный диапазон субстратов. Направленная эволюция, например, была использована для расширения синтетических возможностей аминоксидаз для применения в асимметричном синтезе широкого ряда аминов [51-53].Здесь мы описываем, как направленная эволюция использовалась для расширения области применения альдолаз в синтетической химии путем модификации или расширения репертуара принятых субстратов.

N -Лиаза ацетилнейраминовой кислоты (NAL) представляет собой альдолазу класса I, которая катализирует конденсацию пирувата с N -ацетилманнозамином ( 1 ). Фермент дикого типа принимает широкий спектр пяти- и шестиуглеродных альдегидов в качестве субстратов и, таким образом, может использоваться для получения многих производных сиаловой кислоты.Фермент был разработан для увеличения его активности по отношению к альдегидным субстратам общей структуры 3 () [42]. Насыщенный мутагенез был использован для нацеливания на остатки (D191, E192 и S208), которые, как известно из структурных исследований [54], контактируют с концевой триольной группой аналога продукта (). Варианты альдолаз проверяли на их способность катализировать ретроальдольную реакцию субстрата 4 (R ¹ = R ² = Pr). Был идентифицирован вариант фермента, E192N, который катализирует расщепление 4 (R ¹ = R ² = Pr)> в 5 раз более эффективно, чем фермент дикого типа, катализирует расщепление N – ацетилнейраминовая кислота.Примечательно, что вариант фермента E192N имел широкую область применения и мог использоваться в параллельном синтезе небольшой библиотеки аналогов сиаловой кислоты общей структуры 4 [55]; родственные соединения, такие как 5 , являются мощными и селективными ингибиторами сиалидазы гриппа A [56,57].

Haemophilus influenzae Структура NAL в комплексе с аналогом субстрата, 4-оксосиаловой кислотой [54], с ключевыми остатками, пронумерованными в соответствии с белком E. coli .Остатки Asp-191, Glu-192 и Ser-208 контактируют с боковой цепью триола субстрата и были идентифицированы как мишени для исследований мутагенеза с насыщением. Lys-165 образует основание Шиффа с пируватом.

Направлял эволюцию альдолазы для применения в параллельном синтезе миметиков сиаловой кислоты [55]. Показана разница между субстратной специфичностью фермента дикого типа (зеленый) и мутанта E192N (синий).

Многие ферменты альдолазы эволюционировали, чтобы принимать фосфорилированные субстраты.Однако химики-синтетики редко хотят получать фосфорилированные продукты, а это означает, что часто необходимо дефосфорилирование после альдольной конденсации [58,59]. Проблема особенно остро стоит в случае дигидроксиацетонфосфат (DHAP) -зависимых альдолаз, которые имеют строгую потребность в DHAP в качестве донорного субстрата. Кроме того, DHAP довольно нестабилен, и поэтому с ним может быть сложно работать. Для решения этой проблемы Вонг использовал направленную эволюцию, чтобы создать вариант l-рамулозо-1-фосфатальдолазы (RhaD), который принимает дигидроксиацетон (DHA, 8 ) в качестве донора () [49].

Направлял эволюцию l-раманозо-1-фосфатальдолазы (RhaD), чтобы принять нефосфорилированный донор, дигидроксиацетон ( 8 ), в качестве донора [49]. Показана разница между субстратами, принимаемыми ферментами дикого типа (зеленый) и вариантными (синий).

Библиотека подверженной ошибкам ПЦР (ep-PCR) из генов rha D была введена в селекционный штамм и позволила расти на минимальной среде с l-рамнозой, предшественником l-рамнулозы, в качестве единственного источника углерода.Метод отбора включал использование штамма E. coli , который был дефицитным по рамнулозокиназе (RhaB). Эти клетки могут выжить только в том случае, если нефосфорилированный субстрат, l-рамнулоза, RhaD будет принят и расщеплен вариантом RhaD с образованием гликолитических предшественников l-лактальдегида и дигидроксиацетона. Благодаря принципу микроскопической обратимости, эти вариантные ферменты также будут способны принимать дигидроксиацетон в качестве субстрата и, следовательно, будут полезны в синтезе нефосфорилированных сахаров.Трансформанты из библиотеки ep-PCR росли после 3-дневной инкубации, и быстрорастущие клетки обогащались посевом в свежую минимальную среду / бульон с 1-рамнозой. Две плазмиды, выделенные из двух циклов обогащения, секвенировали, и было показано, что они обладают двумя одинаковыми аминокислотными заменами (C142Y и T158S). Следовательно, использование протокола отбора позволило направленное развитие фермента, способного принимать нефосфорилированный субстрат.

2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолаза (DERA) была разработана для использования в синтезе статиновых препаратов [40].Эта альдолаза необычна тем, что катализирует конденсацию между двумя альдегидами: ацетальдегидом и d-глицеральдегид-3-фосфатом (). DERA был рационально переработан, чтобы увеличить его активность по отношению к некоторым нефосфорилированным акцепторам: мутант, S238D, показал 2,5-кратное улучшение активности по отношению к d-глицеральдегиду [60,61].

Направленная эволюция 2-дезоксирибозо-5-фосфатальдолазы (DERA) для применения в синтезе статиновых препаратов, таких как Lipitor ^® (аторвастатин), 15 [40].Синтез альдегида 14 включает две последовательные реакции, катализируемые альдолазой, в которых 3-хлорпропаналь конденсируется с двумя молекулами ацетальдегида. Вариант фермента, таким образом, способен принимать оба альдегида 12 и 13 в качестве акцепторов. Указано различие между субстратами, принимаемыми ферментами дикого типа (зеленый) и вариантами (синий и желтый, для двух катализируемых стадий).

Поскольку DERA катализирует конденсацию двух альдегидов, исходный продукт конденсации, в принципе, может действовать как акцептор во второй реакции конденсации.Например, конденсация 3-хлорпропаналя, 12 , с двумя молекулами ацетальдегида даст двойной альдольный продукт, 14 ; альдегид 14 является потенциальным предшественником боковых цепей статиновых препаратов. 3-Хлорпропаналь является плохим субстратом для DERA и фактически инактивирует фермент при более высоких концентрациях. Библиотека вариантов DERA была подготовлена ​​с использованием подверженной ошибкам ПЦР. Варианты ферментов проверяли с помощью высокопроизводительной ГХ-МС на их способность катализировать образование двойного альдольного аддукта 14 .Перспективные варианты также были проверены на устойчивость к инактивации 3-хлорпропаном. Терминальный удлиненный тройной мутант C – (F200I / S258T / Y259T) имел лучшие каталитические свойства при более высоких концентрациях 3-хлорпропаналя и был эффективным катализатором для синтеза ключевого промежуточного соединения 14 .

Общие подходы к направленной эволюции альдолаз для получения стереоизомерных продуктов

Получение молекул в виде отдельных стереоизомеров было доминирующей темой в синтетической химии в течение последних 25 лет.Многие реакции, катализируемые альдолазой, являются синтетически полезными, что приводит к продуктам с высокой стереоселективностью. Однако во многих случаях было бы полезно получить стереоизомер обычного продукта реакции, катализируемой альдолазой. Для решения этой проблемы можно использовать два различных подхода, оба из которых были решены с помощью направленной эволюции. Эти альтернативные подходы проиллюстрированы в контексте направленной эволюции гипотетического пируват-зависимого фермента альдолазы.

Гипотетические примеры направленной эволюции альдолазы, которая катализирует конденсацию между пируватом и альдегидом 16 . (A) Направленная эволюция альдолазы, которая принимает стереоизомерный субстрат, ent- 16 . Здесь конфигурация вновь образованного стереогенного центра (C-4) одинакова для альдолазных реакций, катализируемых ферментами дикого типа и мутантными ферментами. Продуктами двух реакций являются диастереоизомеры – 17 и 18 являются эпимерными по C-5, однако, поскольку исходные материалы являются энантиомерами.Показана разница в субстратной специфичности фермента дикого типа (зеленый) и вариантного (синий). (B) Направленная эволюция альдолазы с измененным стереохимическим курсом. Здесь исходные материалы, пируват и 16 , для реакций альдолазы дикого типа и мутантной альдолазы одинаковы. Продукты являются диастереоизомерными, поскольку ферменты катализируют атаку пирувата на противоположных сторонах альдегида 16 , что приводит к образованию стереоизомерных продуктов , 17 и 19 .Разница между товарами обозначена желтым цветом.

Направленная эволюция альдолаз, которые принимают стереоизомерные субстраты

Субстратную специфичность альдолазы можно изменить, чтобы принять стереоизомер природного субстрата. Такой подход неизбежно приведет к образованию продукта, который является диастереоизомером природного продукта (А). Здесь измененная конфигурация продукта проистекает только из измененной конфигурации принятого исходного материала.Следовательно, для синтетических целей нет строгой необходимости изменять субстратную специфичность фермента альдолазы. Фермент, который был способен принимать и стереоизомерных субстратов, может быть получен: химик-синтетик затем сможет изменить конфигурацию продукта реакции, полученного путем выбора конфигурации используемого субстрата.

Направленная эволюция альдолаз с модифицированным стереохимическим ходом

Реакции альдольной конденсации могут приводить к образованию двух новых стереогенных центров.В гипотетических примерах в донорном субстрате является пируват, и, таким образом, образуется только один новый стереогенный центр. Конфигурация нового стереогенного центра в C-4 продуктов определяется лицевой стороной альдегида, который подвергается атаке во время механизма реакции (см.). Следовательно, используя те же субстраты, что и фермент дикого типа, можно получить эволюционировавший вариант фермента, который может катализировать образование диастереоизомерного продукта (B). Здесь измененная конфигурация продукта связана с изменением стереохимического хода образования углерод-углеродной связи.В отличие от подхода (а) (см. Выше), должен быть создан действительно селективный фермент: выделившийся фермент должен контролировать стереохимию конденсации субстратов.

Направленная эволюция альдолаз, которые принимают стереоизомерные субстраты

Получение стереоизомерных продуктов естественной альдолазной реакции в настоящее время продемонстрировано в ряде случаев путем разработки или развития субстратной специфичности фермента. В каждом из следующих примеров фермент был изменен, чтобы принять субстрат с различными структурными изменениями, включая, но не ограничиваясь, его конфигурацию.Ранее другие ферменты, такие как гидантоиназы [62] и липазы [63], эволюционировали селективно, чтобы принимать энантиомер природного субстрата.

Вонг создал вариант NAL, который принимает l-арабинозу ( 20 ) вместо N -ацетилманнозамина ( 1 ) [45,46]. Структуры 1-арабинозы и N -ацетилманнозамина различаются по ряду аспектов. Критически важно, чтобы субстраты были эпимерными как по С-2, так и по С-4, и поэтому продукты ферментативной реакции обязательно должны быть эпимерными по С-5 и С-7 ().Кроме того, однако, 1-арабиноза усечена одним атомом углерода и имеет гидроксильную группу, а не N -ацетильную группу при С-2.

Направленная эволюция лиазы N -ацетилнейраминовой кислоты (NAL) для принятия усеченного субстрата [45,46]. Показаны различия в субстратной специфичности ферментов дикого типа (зеленый) и вариантных (синий). Подложки 1 и 20 являются эпимерными как в С-2, так и в С-4, и, следовательно, продукты 2 и 21 являются эпимерными как в С-5, так и в С-7.Кроме того, 20 является усеченным аналогом 1 , который также имеет другой заместитель у C-2.

Направленную эволюцию проводили с использованием ep-PCR, где 1000 колоний в каждом цикле проверяли на их способность принимать 3-дезокси-1- манно -октулозоновую кислоту (1-KDO). Для мониторинга активности мутантов использовали сопряженный анализ: при расщеплении l-KDO образуется пируват, который немедленно восстанавливается до лактата лактатдегидрогеназой (ЛДГ), и за реакцией следует снижение флуоресцентного сигнала NADH. (возбуждение при 340 нм и поглощение при 450 нм).Наиболее активные мутанты были отобраны, охарактеризованы и использованы в качестве матрицы в последующих раундах ep-ПЦР. Лучший мутант был получен после пяти раундов ep-ПЦР: он имел восемь аминокислотных замен фермента дикого типа, все из которых находились за пределами активного сайта. Этот мутант пятого раунда имел константу специфичности ( k _cat / K _M ) для неестественного сахара, l-KDO, которая была подобна таковой для фермента дикого типа для его природного субстрата, N -ацетил-d-нейраминовая кислота.A> 1000-кратное улучшение соотношения констант специфичности [ k _cat / K _M (l-KDO)] / [ k _cat / K _M ( N -ацетил-d-нейраминовая кислота)].

Другой отличный пример альдолазы, способной принимать стереоизомерный субстрат, был также описан Вонгом [43]. Первый этап эволюции d-2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат (KDPG) альдолазы включал создание фермента, который принимал нефосфорилированный субстрат.Библиотека из 2400 вариантов KDPG-альдолазы была создана с использованием ep-PCR с 2-3 заменами оснований на ген. Варианты подвергали скринингу с использованием анализа сопряженных ферментов на их способность расщеплять (нефосфорилированный) 2-кето-3-дезоксиглюконат ( 24 ): в этом анализе 1% вариантов были более активными, чем фермент дикого типа. Четыре мутантных фермента были охарактеризованы, объединены и подвергнуты перетасовке ДНК [64]. Лучший вариант второго поколения был подвергнут еще одному раунду ep-ПЦР, и был идентифицирован улучшенный вариант третьего поколения.Вариант третьего поколения имел 3-кратное увеличение k _cat и 23-кратное снижение K _M по сравнению с ферментом дикого типа, т. Е. 70-кратное улучшение каталитической эффективности ( k _cat / K _M ) в сторону расщепления KDG.

Направленная эволюция d-2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы [43]. Был разработан вариант фермента, принимающий нефосфорилированный субстрат, d-глицеральдегид ( 23 ).Однако следствием процесса эволюции было то, что энантиомерный нефосфорилированный субстрат, l-глицеральдегид ( ent – 23 ), также был субстратом для варианта фермента. Вариант фермента можно использовать для получения любого из диастереоизомерных продуктов, 24 или 25 . Различия между субстратами, принимаемыми ферментами дикого типа и вариантными, показаны синим и зеленым цветом.

Также была исследована способность варианта третьего поколения принимать как l-, так и d-глицеральдегид в синтетическом направлении.d-Глицеральдегид ( 23 ) является плохим субстратом для фермента дикого типа в условиях анализа, тогда как вариантный фермент показал 1,8-кратное улучшение скорости реакции. Скорость добавления пирувата к 1-глицеральдегиду ( ent- 23 ) была улучшена более чем в 5 раз по сравнению с ферментом дикого типа. Путем скрининга способности расщеплять альтернативный нефосфорилированный субстрат был получен вариант альдолазы KDPG, которая, что примечательно, также способна принимать энантиомерный субстрат, l-глицеральдегид.Было показано, что такая альдолаза с расширенным репертуаром катализирует получение альтернативных диастереомерных продуктов ( 24 и 25 ) путем варьирования энантиомера поставляемого глицеральдегида.

Значение каталитических свойств образовавшейся альдолазы можно объяснить с помощью схематической диаграммы энергетического профиля, показанной на. Мутантный фермент способен катализировать альдольную реакцию и энантиомеров глицеральдегида ( 23 и ent- 23 ).Таким образом, простым выбором энантиомера поставляемого глицеральдегида можно изменять стереоизомер полученного продукта.

Схематическая диаграмма энергетического профиля реакций, катализируемых вариантом фермента (E). Схематически показаны изменения свободных энергий Гиббса для концентраций субстратов, используемых в экспериментах ([субстрат] < K _M ), ​​а не для стандартных состояний 1 M. Результат реакции определяется энантиомером подложка в комплекте ( 23 или ent – 23 ).Вариант фермента E может принимать в качестве субстрата любой энантиомер глицеральдегида, что приводит к образованию альтернативных продуктов ( 24 или 25 ).

Направленная эволюция альдолаз с модифицированным стереохимическим курсом

Конфигурация продукта реакции, катализируемой альдолазой, также может быть изменена путем изменения стереохимического курса образования углерод-углеродной связи. Берри и Нельсон использовали направленную эволюцию для модификации стереохимического курса, катализируемого двумя разными ферментами альдолазы, NAL [41] и тагатозо-1,6-бисфосфатальдолазой (TBP-альдолаза) [47].

Тагатозо-1,6-бисфосфатальдолаза была разработана для синтеза (3 S , 4 S ) -конфигурированного продукта, фруктозо-1,6-бисфосфата 27 вместо (3 S , 4 R ) -конфигурированный продукт, тагатозо-1,6-бисфосфат 26 () [47]. Разнообразие было внесено в ген TBP-альдолазы посредством трех раундов перетасовки ДНК [64], в среднем с одной заменой аминокислоты на продукт гена. Варианты ферментов подвергали скринингу в обратном направлении путем обнаружения d-глицеральдегид-3-фосфата с использованием анализа сопряженных ферментов.Удивительно, но специфичность эволюционированной альдолазы в результате перетасовки ДНК третьего поколения (h36Y / D104G / ​​V121A / P256L) не была дополнительно улучшена посредством мутагенеза с насыщением в положениях 26, 104, 121 и 256. Остатки His-26, Asp-104 , и Pro-256 близки к активному центру фермента и были идентифицированы как остатки, которые вносят ключевой вклад в стереохимический контроль ().

Кристаллическая структура тагатозо-1,6-бисфосфатальдолазы в комплексе с аналогом DHAP, фосфогликологидроксаматом [65].Направленная эволюция позволила идентифицировать ключевую роль остатков 26, 104 и 256 в стереохимическом контроле. В ферменте дикого типа остатки h36 и P256 близки к R257, который образует часть сайта связывания C-6-фосфата. D104 участвует в сети водородных связей с H83, который хелатирует каталитический ион цинка. Вариант h36Y / D104G / ​​V121A / P256L катализирует конденсацию DHAP и d-глицеральдегид-3-фосфата с образованием фруктозо-1,6-бисфосфата с прим. Диастереоселективность 4: 1 [47].Комбинация мутаций, идентифицированных в вариантном ферменте, должна переориентировать реагенты таким образом, чтобы в переходном состоянии атаковалась поверхность si альдегидного субстрата.

Управлял эволюцией тагатозо-1,6-бисфосфатальдолазы в фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазу [47]. Стереохимический ход реакции был изменен, так что конфигурация продукта в C-4 была изменена. Ферменты дикого типа и мутантные ферменты принимают одни и те же субстраты, DHAP и d-глицеральдегид-3-фосфат ( 10 ), но конфигурация одного из стереогенных центров, образующихся в реакции, различна.Показаны различия между структурами продуктов, продуцируемых ферментом дикого типа (зеленый) и вариантным ферментом (синий). Мутантный фермент избирательно продуцирует стереоизомер, фруктозо-1,6-бисфосфат ( 27 ), обычного продукта, тагатозо-1,6-бисфосфата ( 26 ). Изменение в продуцируемом продукте происходит из-за воздействия промежуточного ендиолата, полученного из DHAP, на поверхность si , а не на поверхность re альдегидной группы.

Выделенная альдолаза показала 80-кратное улучшение k _cat / K _M в отношении неприродного субстрата, фруктозо-1,6-бисфосфата ( 27 ), что привело к 100-кратному увеличению изменение стереоселективности.Изменение стереоселективности можно объяснить атакой донора, DHAP, на противоположную сторону акцепторного альдегида, глицеральдегид-3-фосфата, по сравнению с ферментом дикого типа. В синтетическом направлении было показано, что мутантный фермент катализирует образование фруктозо-1,6-бисфосфата с ок. Диастереоселективность 4: 1.

Стереохимический курс другой альдолазы, NAL, также был изменен Берри и Нельсоном [41]. Показано, что вариант E192N, ранее описанный в этом обзоре (см.), Обладает широкой субстратной специфичностью.К сожалению, вариант E192N демонстрирует плохой стереохимический контроль альдольной реакции, что ограничивает его применение в синтетической органической химии. Для кинетически контролируемой реакции селективность определяется разницей в свободной энергии конкурирующих переходных состояний. Вариант E192N катализирует расщепление обоих диастереомерных продуктов (4 S ) – и (4 R ) – 4 . Переходные состояния, определяющие продукт, были близки по свободной энергии, поэтому в прямом направлении наблюдалась плохая стереоселективность.Таким образом, вариант E192N был использован в качестве отправной точки для создания как (4 R ) -, так и (4 S ) -селективных альдолаз ().

Направлял эволюцию пары комплементарных альдолаз, которые катализируют альдольные реакции с разными стереохимическими ходами [41]. Реакция, катализируемая вариантом E192N, не была очень стереоселективной, приводя к смеси стереоизомерных продуктов (зеленый). Образовавшиеся ферменты катализируют атаку пирувата на противоположных сторонах альдегида 3 , что приводит к селективному образованию стереоизомерных продуктов.Дополнительные альдолазы являются синтетически полезными и могут использоваться для получения любого из продуктов (4 S ) – и (4 R ) – 4 с высокой (> 98: <2) стереоселективностью. Различия между структурами этих продуктов показаны синим и желтым цветом.

Библиотеки мутантов были сконструированы с использованием гена, кодирующего E192N, в качестве отправной точки. Скрининг проводился в обратном альдольном направлении с обнаружением пирувата с использованием анализа связанных ферментов.Перспективные мутанты были исследованы с использованием обоих диастереоизомерных скрининговых субстратов (4 S ) – и (4 R ) – 4 , чтобы идентифицировать действительно селективные ферменты.

В первом раунде направленной эволюции была сконструирована библиотека ep-PCR, и было проверено ~ 2500 клонов. Около 1% членов библиотеки показали значительные различия в активности между двумя диастереоизомерными скрининговыми субстратами, (4 S ) – и (4 R ) – 4 .Два варианта были отобраны как демонстрирующие большую стереоселективность, чем «родительский» вариант E192N. Выбранный селективный мутант 4 R содержал четыре изменения в дополнение к замене E192N: A93V, F109I, N153K и S208G. Напротив, выбранный 4-селективный вариант S содержал другой набор из шести замен (по сравнению с «родительским» E192N): T3M, A10V, T48A, Q61R, E64D и Q173R. Сайт-направленный мутагенез использовали для определения того, какие из этих остатков играют доминирующую роль в стереохимическом контроле.Было обнаружено, что три ключевых остатка, Ala-10 и Thr-48 и Ser-208 (нумерация E. coli ), которые находятся в прямом контакте с субстратом, способствуют контролю стереохимии образования углерод-углеродной связи () . Было обнаружено, что мутации T48V и A10V действуют синергетически и в сочетании – в A10V / T48V / E192N – создают фермент, который является селективным в отношении расщепления (4 S ) – 4 .

Haemophilus influenzae Структура NAL в комплексе с аналогом субстрата, 4-оксосиаловой кислотой [54], с ключевыми остатками, пронумерованными в соответствии с E.coli белок. Выделены остатки Ala-10, Thr-48, Ser-208 и Thr-167, и было показано, что они играют ключевую роль в контроле стереохимического хода образования углерод-углеродной связи. Lys-165 образует основание Шиффа с пируватом. Варианты E192N / T167V и E192N / T167G были селективными для расщепления (4 R ) – и (4 S ) – 4 соответственно, и, таким образом, остаток 167 играет особенно важную роль в стереохимическом контроле. . Из программы в целом, E192N / T167V / S208V был наиболее селективным для расщепления (4 R ) – 4 , тогда как E192N / T167G был наиболее селективным для расщепления (4 S ) – 4 .

Результаты скрининга библиотеки ep-PCR послужили основой для дальнейших экспериментов. Кроме того, остаток 167 был идентифицирован как потенциально важный остаток, поскольку эквивалентный остаток, Thr-157, в 2-кето-3-дезоксиглюконатальдолазе (KDGA) образует водородную связь с гидроксильной группой C-4 своего продукта [66] . Таким образом, насыщающий мутагенез аминокислот в положениях 10, 48, 167 и 208 был предпринят для оптимизации стереохимических свойств альдолаз. Было обнаружено, что варианты E192N / T167V и E192N / S208V являются селективными для расщепления (4 R ) – 4 .Напротив, E192N / T167G продемонстрировал превосходную стереохимическую дискриминацию и был по меньшей мере в 50 раз селективным в отношении расщепления диастереоизомерного субстрата (4 S ) – 4 . Эти эксперименты показали, что варианты E192N / T167V и E192N / T167G обладают дополнительными каталитическими свойствами и, таким образом, остаток 167 играет особенно важную роль в стереохимическом контроле. Наиболее 4 S -селективный фермент, E _{4 S} , был двойным мутантом E192N / T167G.Наиболее 4 R -селективный фермент, тройной мутант E _{4 R} (T167V / E192N / S208V), был обнаружен путем объединения ключевых мутаций (T167V и S208V), выявленных в более ранних поколениях.

Было показано, что большинство 4 S – и 4 R -селективных альдолаз являются полезными катализаторами для синтетической химии: конденсация пирувата с альдегидом ( 3 ) позволила получить либо стереоизомерный продукт – (4 S ) – или (4 R ) – 4 – для приготовления простым выбором фермента – E _{4 S} или E _{4 R} – используется.

Результат направленной эволюции пары стереохимически комплементарных альдолаз схематично проиллюстрирован на рис. Ранее в этом обзоре мы описали пример вариантной альдолазы, которая была способна принимать или энантиомер глицеральдегида в качестве субстрата, и выбор того, какой стереоизомер был получен, определялся варьированием поставляемого субстрата. Напротив, высокоселективные ферменты необходимы для контроля стереохимического курса образования углерод-углеродной связи.Здесь одни и те же субстраты могут конденсироваться с образованием альтернативных стереоизомерных продуктов, и фермент должен контролировать этот процесс для получения единичных стереоизомеров. Оба дополнительных варианта NAL контролируют стереохимический ход образования углерод-углеродной связи: в обоих случаях существует значительная разница в свободной энергии (ΔΔ G ^‡ ) между переходными состояниями, определяющими продукт. Таким образом, выбор из пары вариантов ферментов может быть использован для получения либо (4 S ) – и (4 R ) – 4 с высокой стереоселективностью.

Разработка стереохимического протекания альдолазных реакций. (A и B) Схематические диаграммы энергетических профилей дополнительных 4 S – и 4 R -селективных альдолаз, E _{4 S} и E _{4 R} . Схематически показаны изменения свободных энергий Гиббса для концентраций субстратов, используемых в экспериментах ([субстрат] < K _M ), ​​а не для стандартных состояний 1 М. В каждом случае фермент определяет конфигурацию стереогенных центров. образуется в альдольной реакции.Исходные материалы (например, пируват и 3 ) могут конденсироваться с образованием двух возможных стереоизомерных продуктов (4 S ) – или (4 R ) – 4 . Для того, чтобы реакция была синтетически полезной, ферменты должны контролировать стереохимический ход реакции так, чтобы только один стереоизомер производился с высокой стереоселективностью. Стереохимический ход контролируется разницей в свободной энергии (ΔΔ G ^‡ ) между двумя переходными состояниями, определяющими продукт.Была создана пара стереоселективных вариантов NAL, E _{4 S} и E _{4 R} , что позволяет использовать оба возможных стереоизомерных продукта (4 S ) и (4 R ) – 4 , должен быть получен с высокой (> 98: <2) стереоселективностью: полученный продукт просто зависел от варианта фермента (E _{4 S} и E _{4 R} ) использовал.

Удивительный результат направленной эволюции заключается в том, что можно получить новое понимание механистической энзимологии.В эволюции стереохимического протекания двух альдолаз – NAL и тагатозо-1,6-бисфосфатальдолазы – остатки, ответственные за стереоконтроль, были близки к активному центру фермента. Эти остатки должны управлять реакцией между донорным и акцепторным субстратами, контролируя поверхность атакуемого альдегида. Открытие – для двух альдолаз – того, что небольшое количество остатков рядом с активным центром может контролировать стереохимический ход образования углерод-углеродной связи, примечательно и может помочь направлять другие программы направленной эволюции.При использовании NAL все ключевые идентифицированные остатки находились в активном центре фермента. Напротив, в случае тагатозо-1,6-бисфосфатальдолазы ключевые остатки были немного более удаленными и нарушали сети водородных связей с субстратом. Путем нацеливания на остатки, близкие к активному центру, однако, можно изменить стереохимический курс многих других ферментов, образующих углерод-углеродную связь. Такие ферменты также будут иметь огромное значение в стереоконтролируемом органическом синтезе.

Резюме

В этом обзоре мы сосредоточились на направленной эволюции альдолаз с синтетически полезными свойствами.Для начала мы описали примеры эволюционировавших альдолаз с расширенной субстратной специфичностью. Такие ферменты являются полезными катализаторами для синтетической химии, поскольку они катализируют образование неприродных продуктов: продуктов, которые больше не фосфорилируются или имеют модифицированные боковые цепи. Направленная эволюция ферментов с этой новой активностью может дать новое понимание факторов, которые позволяют ферментам распознавать субстраты и переходные состояния.

Во второй части обзора мы описали, как направленную эволюцию можно использовать для создания ферментов для стереоселективного органического синтеза.Могут быть созданы смешанные альдолазы, которые способны принимать более одного стереоизомерного субстрата: такие альдолазы можно использовать для получения более чем одного стереоизомерного продукта за счет выбора предоставленного субстрата. Также возможно создание ферментов с модифицированным стереохимическим курсом, то есть ферментов, контролирующих конфигурацию стереогенных центров, образующихся в альдольной реакции. Чтобы такие ферменты были синтетически полезными, они должны обладать высокой стереоселективностью, определяя, таким образом, получаемый стереоизомер.Эволюция ферментов с измененными стереохимическими курсами может дать новое понимание механистической энзимологии. Такие идеи могут быть полезны в направленной эволюции других ферментов, образующих стереоселективные углерод-углеродные связи.

Благодарности

Мы благодарим BBSRC, EPSRC и Wellcome Trust за финансирование нашей целевой программы исследований эволюции.

Сноски

¹ Используемые сокращения: DAHP, 3-дезокси-d-арабиногептулоза; ГХ-МС, газовая хроматография-масс-спектрометрия; DHAP, дигидроксиацетонфосфат; RhaD, 1-рамулозо-1-фосфатальдолаза.

Список литературы

Сладкая химия пяти летних фруктов

Счетчик просмотров: 27149 Просмотры

Вы можете слышать много разговоров о том, что продукты, не содержащие химикатов, являются самыми полезными для вас и вашей семьи. Но даже мать-природа знает, что химические вещества есть во всем, включая самые полезные и вкусные продукты.

Например, метилбутаноат, антоцианы и ауксин – это лишь некоторые из более чем 350 химических веществ, которые естественным образом встречаются в клубнике.И хотя эти химические названия нелегко распознать, они помогают сделать клубнику сочной и сладкой.

Узнайте больше о природных химических веществах, содержащихся в клубнике и других сезонных летних фруктах, ниже:

Клубника

Пик сезона: с мая по август

Химический факт: Процесс созревания клубники контролируется гормоном ауксином. Когда процесс достигает пика, клеточные стенки плодов начинают разрушаться, и клубника становится сочной.

См. Химический состав на графике из CompoundChem и Chemical & Engineering News.

Ежевика

Пик сезона: июнь на юге, июль на севере

Химический факт: Ежевика содержит высокий уровень антоцианов (химическая структура изображена ниже) и других фенольных соединений, в основном флавонолов и эллагитаннинов, которые способствуют их высокой антиоксидантной способности.

Узнайте больше о химических веществах в ежевике в Североамериканской ассоциации малины и ежевики.

Малина

Пик сезона: Начало июля

Химический факт: Малина содержит 200 химических молекул, которые придают ей характерный вкус. Одно из этих соединений, кетон малины, используется в конфетах, мыле и свечах для придания им ягодного запаха и / или вкуса. Этилформиат, еще одно из соединений, придающих аромат малине, также был обнаружен в центре нашей галактики.

Узнайте больше о химических веществах в малине от Североамериканской ассоциации малины и ежевики.

См. Раздел CompoundChem по химическим веществам малины ниже.

Черника

Пик сезона: С середины июня до середины августа в Северной Америке

Химический факт: Черника содержит птеростильбен, химическое вещество, которое, по мнению некоторых исследователей, может быть использовано в качестве потенциального лекарства от ожирения.

См. Химию на графике от учителя химии Джеймса Кеннеди ниже.

Инжир

Пик сезона: С конца июня до начала осени

Химический факт: Инжир содержит химический бензальдегид, который, по мнению некоторых ученых, может подавлять рост раковых клеток. Бензальдегид также можно использовать в качестве средства запаха или растворителя (для очистки или обезжиривания) на производстве.

Узнайте больше о химическом составе инжира в исследовательской статье из Международного журнала PharmTech Research.

Grape Berry – Оксфордская стипендия

Страница из

НАПЕЧАТАНО ИЗ ОНЛАЙН-СТИПЕНДИИ ОКСФОРДА (oxford.universitypressscholarship.com). (c) Авторские права Oxford University Press, 2021. Все права защищены. Отдельный пользователь может распечатать одну главу монографии в формате PDF в OSO для личного использования.дата: 02 октября 2021 г.

Глава:

13 (стр.90) (стр.91) Виноградная ягода

Источник:

Химия вина

Автор (ы):

Дэвид Р. Далтон

Издатель:

Oxford University Press

DOI: 10.1093 / oso / 978019022

Начиная с завязывания плодов (обычно ягода винограда теперь составляет от 1,5 до 3,0 мм, то есть менее 1/8 дюйма в диаметре) рост ягод винограда делится на три стадии.Этапы I и III соответствуют периодам быстрого роста, а промежуточная фаза медленного роста называется этапом II. Обычно стадия медленного роста (стадия II) соответствует замедлению стадии I и ускорению стадии III, но ясно, что разные сорта винограда имеют стадии разной длины даже в якобы идентичных условиях. На первой стадии завязывания плодов (также называемой «нуазон») начинается собственное развитие цветочной завязи в виноградную ягоду. Семена в двух семенных полостях (локулы) и мякоти (околоплодник) начинают формироваться.Ококарпий разделяется на экзокарпий (кожа с кутикулой – тонкий восковой налет) и мезокарпий. Мезокарпий по мере роста и деления в конечном итоге (к концу III стадии) будет составлять более 90% веса винограда. Экзокарпий, значительно более тонкий, чем мезокарпий, может иметь толщину всего пять или шесть клеток, а кутикула – только несколько слоев липидов (восковидные, сложные эфиры жирных кислот и соединения, аналогичные соединениям клеточных стенок и оболочки хлоропласта, см. Стр.30 и 31). Именно на этой стадии еще неразвитые ягоды становятся зелеными и твердыми (предполагается, что это происходит из-за присутствия хлорофилла и фотосинтеза в ягодах, а также в листьях).В ягодах мало сахара (сахарозы), но много карбоновых кислот, преимущественно яблочной и винной кислот, а также, как правило, меньшего количества аскорбиновой кислоты (витамина С), гидроксикоричной кислоты и некоторых кислых танинов (рисунки 13.1 и 13.2). . Структура ягод винограда обычно делится на три типа тканей: кожица, мякоть и косточка (рис. 13.3). Первый, кожа, как уже упоминалось, также известен как экзокарпий.

Ключевые слова: конденсация альдольного типа, брассиностероиды, углеводы, дикетопиперазин, эритроза, фарнезол, галактонолактон, гербициды, изомеризация, кетоны

Oxford Online требуется подписка или покупка.Однако публичные пользователи могут свободно искать на сайте и просматривать аннотации и ключевые слова для каждой книги и главы.

Пожалуйста, подпишитесь или войдите для доступа к полному тексту.

Если вы считаете, что у вас должен быть доступ к этой книге, обратитесь к своему библиотекарю.

Для устранения неполадок, пожалуйста, проверьте наш FAQs , и если вы не можете найти там ответ, пожалуйста связаться с нами .

Экстракция фенольных соединений из ягод бузины и различных сортов виноградных выжимок с использованием органических растворителей и / или сверхкритического диоксида углерода

Реферат

Оптимальные условия эксплуатации для извлечения фенольных соединений из виноградных выжимок и ягод бузины. Целью было получение экстрактов с высоким содержанием антоцианов, которые демонстрируют стабильность при хранении и могут быть потенциально интересны для коммерческого применения в качестве натуральных красителей.С этой целью были изучены три сорта виноградных выжимок, произрастающих в Словении (Рефошк, Мерло и Каберне). Результаты сравнивали с экстракцией ягод бузины, которая известна высоким содержанием антоцианов. Одностадийные периодические экстракции выполняли этанолом, этилацетатом и ацетоном в различных соотношениях с водой. Применяли температуры 20 ° C, 40 ° C и 60 ° C. Влияние изменения значений pH экстракционной среды было исследовано в отношении выхода и разложения антоцианов.Применяли двухступенчатую экстракцию, сочетающую экстракцию сверхкритической жидкостью (SFE) и обычную периодическую экстракцию. Наиболее эффективными традиционными растворителями при одностадийной экстракции были смеси органического растворителя и воды при 60 ° C. Предварительная обработка природного материала сверхкритическим CO ₂ (с этанолом в качестве сорастворителя или без него) улучшила экстракцию полифенолов из виноградных выжимок. Этот метод представляет собой альтернативу предварительной обработке растительного сырья, заменяя токсичные органические растворители (например,грамм. гексан). Подкисленная экстракционная среда приводила к более высокому содержанию антоцианов в экстрактах. Однако деградация антоцианов при хранении была выше, что привело к потере интенсивного цвета. Добавление коммерчески доступного экстракта розмарина к экстракционному растворителю улучшило стабильность экстракта виноградных выжимок во время хранения.

Ключевые слова

Экстракция

Органические растворители

Сверхкритический CO ₂

Антоцианы

Виноградные выжимки

Ягоды бузины

Натуральный краситель

, 2008 г.