Химия задания: Азот и его соединения. Химия, 8–9 класс: уроки, тесты, задания.

Баллы F1 на каждый алгоритм для задачи 25×100, задачи 100×100, задачи 500×25 и задачи 500×100. LR = логистическая регрессия; KNN = K ближайших соседей; КОРЗИНА = Дерево решений; RF = случайный лес; NB = Наивный Байес; SVM = машина опорных векторов; LDA = линейный дискриминантный анализ; LSTM = Сеть с долговременной кратковременной памятью

Наивный байесовский алгоритм показывает наихудшую производительность среди классических классификаторов для этой задачи. Большая разница в производительности между Наивным Байесом и LDA подразумевает, что существуют значительные ковариации между признаками отпечатков пальцев, что можно было бы ожидать, и это может быть подтверждено корреляционным анализом. Это может происходить из-за того, что случайные блуждания, которые производят отпечатки пальцев, выполняются на одной и той же подструктуре или из-за того, как вычисляются хэши. Деревья решений кажутся чрезмерно подходящими, особенно при больших размерах выборки. Случайные леса в некоторой степени смягчают это, но снижение производительности дерева решений также влияет на случайные леса.

Производительность машин логистической регрессии и машин опорных векторов почти одинакова, чего и следовало ожидать, поскольку они используют по существу один и тот же метод классификации. Различные функции потерь, используемые в соответствующих градиентных спусках, не оказывают существенного влияния. Однако нелинейные ядра оказали крайне негативное влияние на производительность классификации SVM.

Хотя прямое сравнение следует интерпретировать с осторожностью, поскольку LSTM выполняет задачу классификации, отличную от других классификаторов (т.е. многокомпонентный, а не однокомпонентный), тем не менее, мы можем сделать некоторые замечания относительно полученных оценок F1. Интересно, что мы видим, что с точки зрения общей производительности, хотя LSTM не превосходит другие подходы при размере задачи 100×100 (рис. 7), он работает несколько лучше при размере задачи 100×500 и значительно лучше, чем другие подходы для 500×100. размер задачи (рис. 8). Это означает, что LSTM, по крайней мере, на первый взгляд, лучше подходит для масштабирования в пределах всей онтологии, чем классические подходы, хотя мы не пытались использовать LSTM для категорий размера задач, включающих небольшое количество членов на единицу. класс (т.грамм. с 25 членами), так как производительность сети снижалась с уменьшением количества членов в классе, как и следовало ожидать для такого подхода.

Рис. 8

Скрипичный график оценок F1 по алгоритму для задачи 100×500 (слева) и задачи 500×100 (справа). LR = логистическая регрессия; KNN = K ближайших соседей; КОРЗИНА = Дерево решений; RF = случайный лес; NB = Наивный Байес; SVM = машина опорных векторов; LDA = линейный дискриминантный анализ; LSTM-сеть с долговременной кратковременной памятью

В оставшейся части этого раздела мы более подробно остановимся на оценке сетей.

Сети LSTM были обучены на вышеуказанных наборах данных для 100 эпох с бинарной кроссэнтропией в качестве функции потерь. На рисунках 9, 10, 11, 12, 13, 14 показано изменение различных показателей в ходе этого процесса. Потеря в наборе проверки восстанавливается после 25-й эпохи, что указывает на переоснащение набора данных. Удивительно, но это не влияет на точность и отзыв отрицательно. Для точности вычислений и отзыва мы использовали порог 0,5, чтобы отличить принадлежность к классу от непринадлежности.Дальнейшее изучение прогнозов показывает, что упомянутое отсутствие влияния вызвано тем, что прогнозы отклоняются от оптимальных ответов в сторону порога, но не превышают его. Это означает, что после поворота сила предсказания уменьшается, поскольку расстояние от порога можно рассматривать как уверенность в предсказании. Небольшой, но постоянный рост точности и отзыва после этого поворота указывает на их дополнительное улучшение, но, по-видимому, за счет переобучения.

Кодирование химических веществ не оказывает существенного влияния на успешность выполнения учебного задания.Это означает, что сети успешно изучают структуру маркировки атомов в строках SMILES относительно рано без особых усилий. Были проведены аналогичные эксперименты по обработке естественного языка [44], и результаты показали, что агрегация синтаксических структур влияет на обучение. Наши результаты показывают, что это влияние не существует при агрегации символов в атомы.

Скрипичный график на рис. 15 изображает распределение баллов F1 на молекулу среди различных молекул в наборе для оценки.Обратите внимание на скопления на концах чешуи. Эта форма соответствует поведению отклика сети. Существует подмножество молекул, для которых сеть не дает никакого положительного ответа ни для одного класса, т. е. LSTM не распознает молекулу как члена какого-либо класса. Такое поведение довольно вредно для общего отзыва, но его легко идентифицировать, и поэтому его можно использовать в качестве индикатора того, что для этих молекул следует использовать другие подходы.

Точность на данные на обучение

Точность на данные проверки

Рис. 13

Рис. 14 Рис. 14

Напоминание на данные проверки

Рис. 15

Скриптуальный участок F1 оценки молекул в тестовом наборе после 100 эпох

LSTM были подходом, который не сильно пострадал от больших размеров выборки. Одним из аспектов этого является то, что большие размеры выборки создают более неравномерные проблемные области, с которыми LSTM лучше справляется, поскольку LSTM может делать предсказание с несколькими метками и предсказывать несколько классов одновременно, а не (как случай для других подходов), делая только одно предсказание.Кроме того, как описано выше, процедура выборки данных из онтологии приведет к более общим классам, если количество членов больше. Это означает, что для классификации важны более мелкие субструктуры, которые могут широко распределяться по реальным молекулам. Случайное блуждание имеет меньшую вероятность охвата всех соответствующих аспектов в этом случае. LSTM использует всю строку SMILES, что обеспечивает более последовательную классификацию.

Рисунок 8 показывает, что существует большая разница в производительности w.r.t различных химических классов. Более ориентированный на классы анализ результатов проводится в следующем разделе.

Следует отметить, что мы исследовали несколько конфигураций LSTM, и ни одна из них не работала лучше, чем данная конфигурация, в то время как значительное количество показало почти идентичные результаты на проверочном наборе. Введение отсева привело к явному повышению производительности, в то время как различные размеры и структуры LSTM, даже двунаправленные, не оказали положительного влияния. Возможная причина заключается в том, что существуют некоторые структуры SMILES, которые LSTM изо всех сил пытаются выучить, и в будущей работе мы будем изучать альтернативные кодировки, чтобы обойти такие ограничения.

По химическому классу в рамках онтологии

Как видно из широкого распределения F1-показателей эффективности в рамках каждого из различных размеров задач и алгоритмических подходов, существуют различия в эффективности обучения для разных классов онтологии. В то же время мы видим различия в производительности для разных молекул. Это побуждает нас задаться вопросом, можем ли мы извлечь из этих экспериментов какие-то общие наблюдения о проблеме структурной классификации химических онтологий.

Во-первых, мы можем спросить, дают ли разные алгоритмы одни и те же наиболее эффективные классы или разные наиболее эффективные классы. На рис. 16 показано перекрытие наиболее эффективных классов для задач разного размера для трех наиболее эффективных алгоритмов.

Рис. 16

Диаграммы Венна показывают перекрытие классов, которые набрали F1 более 0,8 (т. е. наиболее эффективные классы) для трех классификаторов в каждом из этих размеров задач. LR = логистическая регрессия; RF = случайный лес; LDA = линейный дискриминантный анализ; LSTM = долговременная кратковременная память

На рисунке 16 показано, что, хотя существует общее общее ядро, разные классификаторы дают частично непересекающиеся наборы классов с «наилучшей оценкой».То есть они имеют частично отличные профили по отношению к классам, для которых они дают наилучшие результаты. Это говорит о том, что общая проблема классификации химических онтологий на основе структуры может выиграть от ансамблевых подходов, которые объединяют результаты различных подходов.

В общем, классические классификаторы лучше всего работают с классами, которые имеют относительно небольшое количество членов и четко определенные структурные особенности. Например, лучшие исполнители (F1 = 1,0), использующие алгоритм LR, имеют менее 50 участников (таблица 1).

Таблица 1. Классы с наивысшим и наименьшим баллом, использующие алгоритм LR

Классы с наихудшими показателями для классических классификаторов, примером которых является наихудший рейтинг для алгоритма LR, указанный в таблице  1, включают классы с функциями, не представленными непосредственно в отпечатки пальцев, такие как D-стереохимия, катионы и соли. Информация, которая потребуется для создания этих классификаций, просто недоступна для изучения этими классификаторами, однако их можно улучшить за счет принятия альтернативных стратегий снятия отпечатков пальцев.

Профиль плохих исполнителей отличается для LSTM по сравнению с классическими подходами (таблица 2).

Таблица 2. Классы с наивысшим и наименьшим баллом, использующие алгоритм LSTM

Классы с наилучшей производительностью с подходом LSTM также включают классы с четко определенными структурными характеристиками, но они имеют гораздо больше членов, чем самые эффективные в подходе LR , иллюстрирующий способность LSTM справляться с задачами большего размера, а также дополнительную ценность дополнительных примеров для обучения.

Классы с наихудшими показателями для LSTM имеют профиль, совершенно отличный от профилей LR, и, как и ожидалось, не включают классы солей или ионов. Скорее, несколько интригующе, мы видим множество примеров классов со сложной кольцевой структурой, особенно с ароматическими или замещенными кольцевыми структурами.

Чтобы подтвердить это наблюдение, мы применили утилиту анализа химического обогащения BiNChE [16] к 50 классам с наихудшими показателями из набора только для LSTM. Мы видим ряд явных обогащений — бензолы, ароматические соединения и карбоциклические соединения (рис.17), в то время как в худших классах из всех алгоритмов мы не видим подобного обогащения.

Рис. 17

Результат анализа обогащения структурной онтологии ChEBI для 50 худших классов в LSTM

Мы можем предположить, что плохие характеристики ароматических молекул с LSTM могут быть связаны с тем, что быть закодированы в строках SMILES несколькими способами — с использованием чередующихся одинарных и двойных связей или с использованием строчных букв. Вполне вероятно, что сеть не узнала, что, например. ароматический атом углерода «с» на самом деле является атомом того же типа, что и типичный «С» в другом молекулярном представлении, и они рассматриваются как разные объекты. Большие наборы данных из, возможно, синтетических источников или более однородное представление ароматических компонентов могут помочь сети изучить эти абстракции. Также стоит отметить, что в целом можно ожидать, что LSTM будет иметь больше трудностей с разбором циклов из строк SMILES, чем с линейными молекулярными структурами, потому что эти структуры разрушаются во время перевода молекулы в ее представление SMILES.

Сравнение с современным инструментом

В качестве окончательной оценки мы сравниваем наши результаты с современным инструментом классификации на основе онтологий ClassyFire [3]. Мы делаем это сравнение, используя в качестве входных данных набор данных размера задачи 500×100, выполняя ClassyFire на строках SMILES, связанных с тестовым набором молекул, охватывающим 20% от полного набора 50 000 молекул, т. е. 10 000 образцов молекул со SMILES. Из них ClassyFire не смог обработать 501 из них из-за ошибок в генерации InChI (международный химический идентификатор IUPAC, [45]) из SMILES.ClassyFire использует кэш родительских классов с индексом InChI-Key для молекул, которые были ранее классифицированы, чтобы повысить производительность классификации, поскольку сопоставление нескольких подструктурных шаблонов обходится дорого. Известны определенные молекулы, для которых невозможно создать InChI, но для которых возможно иметь SMILES, и эти 501 молекула относятся к этому типу — в основном из-за явного представления точек присоединения внутри SMILES, например следующие УЛЫБКИ: ‘C(C(COP(=O)(OC[C@@H](C(=O)O)N)O)OC(=O)*)OC(=O)*’.Также было несколько записей, для которых ClassyFire вернул другие ошибки. Всего мы получили 9 484 результата классификации для наших 10 000 образцов молекул. Каждый результат классификации включает несколько классов ChEBI, включая классы ChEBI очень высокого уровня, такие как «молекулярный объект». Мы сжали их, чтобы включить только классы, которые не являются суперклассами друг друга.

Прямое сравнение наших результатов с производительностью инструмента ClassyFire затруднено по разным причинам.Во-первых, ClassyFire использует другую базовую онтологию, отличную от ChEBI, которая лишь частично сопоставлена ​​с ChEBI. Онтологии различаются некоторыми фундаментальными способами в своем подходе к химическим классам. Например, классы ClassyFire включают молекулы с разным зарядовым состоянием, включая сопряженные основания и кислоты в одной группе, в то время как ChEBI строго разделяет их. Следовательно, предсказания класса ChEBI, возвращаемые ClassyFire, могут быть менее точными, чем исходный класс ClassyFire. Однако наш набор данных ограничен классификацией ChEBI, из которой он был создан.Во-вторых, ClassyFire делает несколько прогнозов родительского класса, в то время как наши классические классификаторы делают только одно прогнозирование родительского класса с наилучшим совпадением, и хотя LSTM может делать несколько прогнозов, он делает гораздо меньше прогнозов, чем ClassyFire. На рисунке 18a показана диаграмма плотности ядра для количества родительских классов при различных подходах: (1) ChEBI напрямую утверждала родителей (со средним значением 1,816 родительских классов на конечную структуру по всей онтологии), (2) родительские классы, предсказанные LSTM ( среднее = 1.435 в задаче 500 x 100) и (3) ClassyFire предсказал родительские классы (среднее = 9,926). И для ClassyFire, и для LSTM эти подсчеты исключают любые родительские классы, возвращаемые алгоритмом, которые являются суперклассами любого из других родительских классов. Наконец, что наиболее важно, ClassyFire с момента своего первоначального выпуска в 2016 году использовался при разработке ChEBI: он используется в конвейере массовой отправки для автоматической классификации объектов, включенных в ChEBI, до того, как их можно будет курировать вручную.Это означает, что ClassyFire фактически создала часть классификаций в нашем наборе данных (как обучающих, так и тестовых), хотя они никак не помечены и не обозначены как таковые. Это вносит предвзятость, с которой трудно полностью справиться.

Рис. 18

a Количество родительских классов при различных подходах. b Длина пути к заявленному родительскому классу в разных подходах. c Минимальная и максимальная длина пути к заявленным родительским классам. d D-глюкопиранозо-3-фосфат, пример молекулы, для которой ClassyFire плохо работает по этому показателю. Обучение относится к выбору членов для классов в учебной задаче

Мы сравниваем подходы, вычисляя расстояние длины пути между тем, что мы можем назвать «основной истиной» утвержденной классификации в ChEBI и предсказанной классификацией. То есть мы подсчитываем количество отношений подклассов, которые необходимо пройти, чтобы перейти от непосредственно утвержденного родителя к предсказанному родителю.На практике более длинные пути, как правило, отражают классификации, которые либо неверны (в другой ветви онтологии), либо не очень полезны (как очень высокий уровень). Таким образом, длина пути обеспечивает полезную метрику качества классификации. Поскольку может быть несколько прямо утвержденных родителей и несколько предсказанных родителей, для каждой структуры в тестовом наборе мы вычислили все длины путей между попарными комбинациями утвержденных и предсказанных классов. Если предсказанный класс был идентичен одному из заявленных родителей, мы добавили длину пути, равную 0, чтобы указать совпадение.Обратите внимание, что заявленные родители в ChEBI не всегда являются классом, который мы использовали в качестве входных данных для наших классификаторов из-за обработки выбора онтологии в целях обучения. Таким образом, мы вычисляем длины путей также для классов, которые мы использовали в качестве выборки. На рисунке 18b показана общая плотность возвращенных длин пути в этой метрике с выбранными классами, обозначенными как «Обучение», показаны результаты для LSTM, лучшего и худшего из классических подходов и ClassyFire.Можно видеть, что ClassyFire возвращает самый широкий диапазон длин пути по этой метрике со средней длиной пути 3,20, в то время как LR (среднее значение = 2,29) превосходит NB (среднее значение = 2,74) и LSTM (среднее значение = 2,81), которые появляются выполнять аналогично. Базовый уровень обучения для наших подходов к обучению имеет среднее значение = 1,48.

Эти результаты могут отражать погрешность, основанную только на количестве вычисленных путей. По этой причине мы рассчитали также минимальную длину пути и максимальную длину пути (рис. 18в). На минимальной длине пути ClassyFire превосходит другие подходы, а на максимальной длине пути показывает наихудшую производительность.Однако на практике для новой структуры без ручной проверки невозможно было бы узнать, какой из возвращенных результатов является лучшей классификацией, что снижает преимущества использования автоматизированного подхода. Хотя ClassyFire обеспечивает порядок в списке классов для своей собственной онтологии, которую можно использовать для определения приоритетов классификации, они не обеспечивают аналогичного ранжирования в своем прогнозировании терминов ChEBI. Чтобы проиллюстрировать, почему максимальная длина пути ClassyFire значительно больше, чем для других подходов, мы рассмотрим молекулу «D-глюкопиранозо-3-фосфат» в качестве примера. В ЧЭБИ классифицируется как глюкозофосфат, производное гексозы. ClassyFire возвращает следующие предсказанные классификации для этой молекулы: «первичный спирт» (CHEBI:15734), «вторичный спирт» (CHEBI:35681), «эфир» (CHEBI:25698), «моноалкилфосфат» (CHEBI:25381), « полиол» (CHEBI: 26191), «оксаны» (CHEBI: 46942), «полуацеталь» (CHEBI: 5653), «гексоза» (CHEBI: 18133) и «органический оксид» (CHEBI: 25701). Многие из этих классификаций относятся к правильным, но очень общим химическим группировкам, иллюстрируя проблемы с подходом на основе подструктуры к автоматизированной онтологической классификации на основе структуры в контексте большого и комбинаторного химического структурного ландшафта.Другие классификации в ChEBI неверны из-за различий между ClassyFire и подходом ChEBI к классификации (например, гексоза против производного гексозы).

ClassyFire уже оказал огромное влияние на области управления химическими данными и анализа наборов данных omics, позволив классифицировать новые структуры. Тем не менее, наши результаты подчеркивают, что подходы на основе динамического машинного обучения играют роль наряду с подходами на основе подструктур. ClassyFire предсказывает для каждой молекулы значительно больше (не избыточных) родительских классов (среднее значение = 9.926), чем LSTM (среднее значение = 1,435) или LR (1 прогноз), где, грубо говоря, часто один из этих предсказанных родительских классов лучше, чем классы, предсказанные LSTM или LR в нашей метрике расстояния пути (подшипник учитывая возможную необъективность из-за использования ClassyFire при разработке ЧЭБИ), но большинство из них хуже. ClassyFire кажется особенно подходящим для полуавтоматических вариантов использования, когда результаты, возвращаемые ClassyFire, проверяются вручную. Однако, если ручная валидация невозможна, другие подходы кажутся более подходящими, в частности, если их можно использовать вместе таким образом, чтобы использовать различные преимущества различных подходов.Важно отметить, что их также, вероятно, будет легче поддерживать и расширять в будущем.

Задание 2 Химия – Это нельзя копировать или заниматься плагиатом!! Я прошел

Это премиум-документ. Некоторые документы на StuDocu имеют статус Premium. Обновите до Premium, чтобы разблокировать его.

Это запрещено копировать или заниматься плагиатом!! Я выполнил задание с этой бумагой. Я горжусь тем, что…Подробнее

Комментарии

• Пожалуйста, войдите или зарегистрируйтесь, чтобы оставлять комментарии.

Текст для предварительного просмотра

Miranda Hardy Chemistry with Lab C832 ID учащегося: 21 июля 2019 г. Задача 2 Центральная роль химии A.Объясните, почему химия считается центральной наукой в ​​интересующей вас отрасли науки: Химия занимает центральное место в биологии, потому что многие биологические идеи содержат в себе химический язык. Например, вы найдете так много языка химии, когда читаете о метаболизме. Все организмы растут и развиваются, что требует энергии. Чтобы расти и получать энергию, организмы проводят в своем теле химические реакции, называемые биохимическими реакциями. Обмен веществ – это общая сумма всех реакций, протекающих в организме организма.(Агравал, П. Биология для химиков, Global Media, 2009) Биология изучает все живые существа. Черты биологии включают метаболизм, размножение, рост, движение, реакцию и сложную организацию. (БарЧартс, 2012). Из 92 стабильных элементов вы найдете только 20 различных типов атомов, составляющих живые организмы. Элементами, составляющими наибольшее количество живых организмов, являются углерод (C), водород (H), азот (N), кислород (O), фосфор (P) и сера (S). Эти 6 элементов имеют небольшую атомную массу и считаются макроэлементами, потому что они составляют массу живых организмов.Такие элементы, как магний, калий, натрий, кальций и йод, необходимы только в следовых количествах и называются составляющими массы живых организмов. Все эти атомы соединяются друг с другом во множестве различных комбинаций, образуя молекулы, удерживаемые вместе ковалентными связями. Роль ионов и многоатомных ионов в биологических молекулах различна. Например, фосфат играет роль в ряде важных молекул, таких как аденозинтрифосфат, АТФ, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, фосфолипиды. Ионы и полярные молекулы, такие как аминокислоты и глюкоза, имеют оболочки или кластеры воды, это влияет на то, как они проходят через мембраны клеточной поверхности.(Campton, J. 2016) Мы используем химию, чтобы объяснить значение каждого биологического процесса, поэтому химия является центральной наукой, центральной в биологии. Ссылки: Агравал, П. (2009). Биология для химиков. Получено из BarCharts, I. (2012). Биология. Получено из Кэмптона, Дж. (2016). Биология: молекулы и клетки. Банбери: Образовательная группа Ходдера.

Химические и потребительские фирмы присоединяются к Целевой группе PLF

«На протяжении многих лет PLF не получали должного внимания, потому что они являются ингредиентами, а не продуктами.Именно их гибкость и полезность делают их такими популярными, и поэтому внедрение экономики замкнутого цикла для этих продуктов сопряжено с рядом технических проблем», — сказал президент RSC Том Велтон. Одним из недостатков является то, что существует очень мало способов их переработки: более 36,25 млн т/год PLF не извлекаются после использования.

«В настоящее время эти ценные химические вещества производятся в огромных количествах, используются и никогда не восстанавливаются. Мы просто должны разрабатывать новые технологии и применять принципы экономики замкнутого цикла для их сбора, повторного использования в качестве новых продуктов и сырья, а также предлагать дополнительные биоразлагаемые и биоразлагаемые альтернативы, добавил Велтон.

PLF обычно используются в качестве загустителей, эмульгаторов и связующих и имеют широкий спектр применения. Существуют сотни различных типов полимеров, включая акриловые, эпоксидные смолы, сложные полиэфиры, полисиликоны, полиуретаны, отверждаемые излучением, виниловые и водорастворимые.

Их восемь ключевых рынков, совокупная глобальная стоимость которых составляет 1 доллар США. 27 трлн – это клеи и герметики; сельское хозяйство; домашняя уборка; краски и покрытия; смазочные материалы; краски и покрытия; средства личной гигиены и косметика; и водоподготовка.

Целевая группа, целью которой является наметить устойчивое будущее для PLF, определила более 200 различных PLF в восьми секторах рынка. Его план действий на 2022 год первоначально сосредоточен на пяти областях:

• создание новых инновационных сетей для содействия сотрудничеству между академическими кругами, промышленностью и политикой;
• определяет и отстаивает ключевые темы и приоритеты исследований для поддержки исследователей и бизнеса в решении инновационных задач PLF;
• изучить возникающую потребность в последовательном подходе к тестированию биоразлагаемости и стабильности PLF;
• исследует возможности для инноваций на основе химии при разработке решений для экономики замкнутого цикла на ключевых рынках, таких как краски, клеи и герметики; и
• взаимодействовать с ключевыми заинтересованными сторонами, чтобы обеспечить использование научно-обоснованного подхода для разработки будущей политики в отношении PLF.

С точки зрения токсичности PLF, как правило, считаются мало опасными для окружающей среды и в настоящее время не подлежат регистрации и оценке в соответствии с европейским регламентом REACH. Тем не менее, RSC заявил, что Европейская комиссия в настоящее время пересматривает это исключение.

Использование катализа антителами для изучения результатов многочисленных эволюционных испытаний химической задачи

Реферат

Антитела к каталитической альдолазе, полученные в результате иммунизации двумя различными, но структурно родственными гаптенами β-дикетона, были клонированы и секвенированы для изучения сходства и различий между независимо развившимися катализаторами.Кинетический анализ и анализ последовательности в сочетании с мутагенезом, структурными исследованиями и исследованиями моделирования показывают, что определяющим событием в эволюции этих катализаторов была соматическая мутация, которая поместила остаток лизина в глубокий, но в остальном неочищенный гидрофобный карман. Мы предполагаем, что ковалентные химические реакции могут быть так же легко выбраны из иммунного репертуара, как и традиционные нековалентные взаимодействия, которые до сих пор составляли основу иммунохимии. Кроме того, мы считаем, что эти эксперименты повторяют определяющие события в эволюции природных ферментов, особенно в том, что касается химического механизма, каталитической неразборчивости и удвоения генов.

Один из самых захватывающих вопросов биологии касается того, что произойдет, если эволюция начнется заново. Для любой системы внутри организма ответ должен частично зависеть от того, сколько существует способов выполнить данную задачу. Например, в случае белковых ферментов проблема сводится к чисто химическому вопросу о возможности аминокислот, действующих совместно, катализировать данное превращение. Если существует много возможных путей, может возникнуть несколько решений проблемы, например, гидролиз амидной связи.Однако даже там, где есть несколько решений, обнаруживаются повторяющиеся мотивы, такие как каталитическая триада сериновых протеаз. Изучение этих вопросов экспериментально затруднено, потому что, кроме экспериментов с «мысленными» экспериментами, как правило, невозможно перезапустить эволюцию системы. Однако появление процесса реактивной иммунизации для создания катализаторов антител позволяет изучить результаты многочисленных эволюционных испытаний для выполнения сложной химической задачи различными членами семейства белков.

Реактивная иммунизация отличается от более обычной процедуры иммунизации тем, что реактивные химические вещества используются в качестве иммуногенов. Таким образом, параметры отбора иммунной системы переключаются с простого связывания на более сложные химические процессы, такие как образование ковалентной связи между антителом и антигеном. Когда выбираемая химия является частью каталитического механизма, результатом часто является эволюция эффективного фермента в режиме реального времени (1–5).

Недавно мы использовали процедуру реактивной иммунизации для получения каталитических альдолаз антител, которые по эффективности и механизму очень похожи на природные альдолазы (1–3).Одной из существенных особенностей альдолаз антител является активный сайт, содержащий глубоко спрятанный остаток лизина с сильно нарушенным pK _и . Этот реактивный лизин взаимодействует с альдольными донорами с образованием енамина, который является зарождающимся углеродным нуклеофилом, который добавляется к альдольному акцептору с образованием новой углерод-углеродной связи с образованием продукта β-гидроксикетона с точным контролем стереохимии на карбинольном углероде. Таким образом, реактивная иммунизация сделала возможным отбор для сложного химического процесса, который требует, среди прочих параметров: ( i ) выбор связывающего кармана подходящей конфигурации для взаимодействия с двумя субстратами в бимолекулярном процессе; ( ii ) активный сайт с доступным остатком лизина; ( iii ) нарушение лизина pK _a ; ( iv ) наличие основания; и ( v ) организация взаимодействия с водой, обеспечивающая образование и гидролиз иминных промежуточных соединений.

В настоящей работе мы поставили перед иммунной системой одну и ту же химическую задачу — изучить результат многочисленных эволюционных попыток создать фермент. Здесь мы представляем наши исследования альдолаз антител, которые проявляют ту же энантиоселективность, тот же очевидный химический механизм, но были получены путем независимой иммунизации мышей дикетоновыми гаптенами 1 и 2 (рис. 1).

Рисунок 1 Антитела к альдолазе

были получены путем реактивной иммунизации 1,3-дикетоновым гаптеном 1 или 2. При реакции гаптенов с антителами к альдолазе образуется стабильное ковалентное взаимодействие. Многостадийная реакция дает стабильный винилологический амид или енаминон. В отличие от гаптена 1 , гаптен 2 включает сульфоновую группу для имитации тетраэдрической геометрии определяющего скорость переходного состояния образования углерод-углеродной связи.

Материалы и методы

Клонирование генов антител.

Гены антител из клеточных линий гибридом, экспрессирующих каталитические антитела 38C2, 33F12, 40F12 и 42F1, клонировали, как описано (6, 7).

Сайт-направленный мутагенез.

Лизин 93 в тяжелой цепи 33F12 и 40F12 был заменен остатком аланина с помощью ПЦР с использованием двух перекрывающихся олигонуклеотидов, несущих желаемую замену. ПЦР проводили с использованием корректорской системы ПЦР Expand High Fidelity PCR System Pow / Taq ДНК-полимеразы (Roche Molecular Biochemicals) для минимизации ошибок ПЦР. Правильные последовательности мутантов были подтверждены секвенированием ДНК.

Субклонирование в вектор экспрессии pIGG.

Используемый здесь вектор экспрессии pIGG представляет собой экспрессию всего IgG человека в клетках млекопитающих (C.R. и C.F.B., неопубликованная работа). Вариабельные домены тяжелой цепи антител подвергали ПЦР-амплификации с использованием системы ПЦР Expand High Fidelity PCR System Pow / Taq , смеси ДНК-полимеразы и специфичных к антителу праймеров, включающих сайты рестрикции, необходимые для клонирования pIGG. Продукты ПЦР расщепляли Sac I и Apa I и лигировали с вектором pIGG, расщепленным Sac I/ Apa I, с использованием ДНК-лигазы T4 (Life Technologies, Gaithersburg, MD).Реакции лигирования трансформировали в штамм Escherichia coli XL-1 Blue (Stratagene) с помощью электропорации. Вариабельные домены легкой цепи антител подвергали ПЦР-амплификации и сливали с каппа-цепью человека с помощью ПЦР с удлинением с перекрытием с использованием системы ПЦР Expand High Fidelity PCR System Pow / Taq , ДНК-полимеразной смеси и специфичных к антителу праймеров, включающих необходимые сайты рестрикции. для клонирования pIGG. Продукты ПЦР расщепляли Spe I и Xba I и лигировали в вектор с соответствующим вариабельным доменом тяжелой цепи, полученным расщеплением Spe I и Xba I и 5′-дефосфорилированием щелочной фосфатазой. из кишечника теленка (Roche Molecular Biochemicals).Реакции лигирования превращали в XL-1 Blue электропорацией. Правильные последовательности клонов pIGG-антитела подтверждали секвенированием ДНК.

Экспрессия и очистка рекомбинантных антител.

Рекомбинантные гибридные мышиные/человеческие IgG-антитела были экспрессированы в временно трансфицированных Т-клетках почки эмбриона человека 293. Почти конфлюэнтные клетки трансфицировали плазмидной ДНК pIGG-антитело с помощью LipofectAMINE PLUS (Life Technologies) в соответствии с процедурой, рекомендованной производителем.После трансфекции клетки культивировали в течение 3 дней в среде DMEM (Life Technologies) с добавлением 10% FBS (Life Technologies). Супернатант клеточной культуры собирали и заменяли свежей средой каждый день. IgG очищали из концентрированных супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии с использованием колонки Protein A HiTrap объемом 1 мл (Pharmacia), присоединенной к системе FPLC (Pharmacia). PBS использовали в качестве буфера для уравновешивания и промывки, а для элюирования использовали 0,5 М уксусную кислоту. Элюированные фракции немедленно нейтрализовали, используя 0.5 объемов 1 М Tris⋅HCl (pH 9,0) объединяли, концентрировали и заменяли на PBS.

Анализ активности.

Альдолазную активность рекомбинантных антител измеряли с использованием флуорогенного метода ретро -альдольного субстрата (8). Реакции проводили в PBS (рН 7,4), субстрат разбавляли из исходного 5 мМ раствора в ацетонитриле до конечной концентрации 200 мкМ. Анализы проводили при комнатной температуре в титрационных микропланшетах в реакционном объеме 100 мкл.Использовали концентрацию антитела 1 мкМ. Образование альдегидного продукта отслеживали с помощью флуоресцентного планшет-ридера, контролируя при λ _ex = 330 нм и λ _em = 452 нм.

Компьютерная модель гомологии.

Матрица для гомологической модели каталитического антитела 40F12 была выбрана путем сравнения последовательностей с нашей базой данных из 120 структурно определенных Fab. В частности, мы использовали область V _L Fab MOPC21 (9) и область V _H Fab 33F12 (2), которые имели наибольшую идентичность последовательностей с V _L и V _H соответственно. 40Ф12.Выбранные матрицы V _L и V _H также имели совпадающие длины CDR, за исключением петли CDR3 тяжелой цепи (h4). Проверка базы данных показала, что Fab 730.1.4 (10) имеет петлю h4 такой же длины. Подгонка по методу наименьших квадратов следов Cα 33F12 и 730.1.4, 10 остатков до и 10 остатков после петли h4, показала, что остатки H92 и h204 представляют собой точки, от которых расходятся структуры CDR3. Следовательно, петля h4 730.1.4 была сплайсирована в 33F12 между остатками H92 и h204.При необходимости остатки в этой предварительной модели были мутированы, чтобы соответствовать последовательности 40F12, а конформации конфликтующих боковых цепей были изменены на основе стандартной библиотеки ротамеров (11). Наконец, модель была уточнена в ходе двух раундов минимизации энергии с помощью программы Discover (Biosym Technologies, Сан-Диего). В первом раунде мутированные боковые цепи были минимизированы с ограничением остальной части модели, а во втором раунде все боковые цепи были минимизированы с ограничением основной цепи.

Результаты и обсуждение

Второе эволюционное испытание.

Наше второе эволюционное испытание началось с синтеза гаптена 2 и получения моноклональных антител (5). Из 11 антител, которые, как было показано, катализируют альдольную реакцию, антитела 40F12 и 42F1 катализировали альдольные реакции присоединения и ретро- -альдольные реакции с энантиоселективностью, сходной с наблюдаемой ранее для антител 33F12 и 38C2 (1–3).Остальные девять каталитических антител демонстрировали изменение энантиоселективности, преимущественно образуя альдолы, противоположные альдолам, образующимся с 33F12 или 38C2. Эти антиподальные катализаторы являются предметом другого отчета (5). Мы ограничили этот анализ антител к альдолазе теми катализаторами, которые проявляют такую ​​же общую энантиоселективность при катализе альдольных реакций.

Антитела 40F12 и 42F1 были впервые идентифицированы по их способности ковалентно реагировать с 2,4-пентандионом с образованием стабильного энаминона (УФ при λ _макс. 318 нм) (1).Подобно антителам 33F12 и 38C2, 40F12 и 42F1 показали характерный максимум поглощения енаминона при 318 нм после инкубации с 2,4-пентандионом (фиг. 2 A ). Затем антитела исследовали на их способность катализировать различные альдольные и ретро-альдольные реакции (таблица 1). Все альдольные и ретро -альдольные реакции, катализируемые антителами, соответствовали кинетике Михаэлиса-Ментен и ингибировались добавлением стехиометрического количества 2,4-пентандиона. Представлена ​​сводка кинетических параметров для альдольных реакций, катализируемых антителами, и ретро- -альдольных реакций (таблица 1).Эти результаты согласуются с программированием реакционноспособного амина в ковалентном каталитическом механизме (1–3). Кроме того, эти антитела повторяют широкий каталитический диапазон, который впервые наблюдался с антителами к альдолазе 33F12 и 38C2.

Рисунок 2

( A ) Антитело к альдолазе 40F12 (сайты связывания 75 мкМ) с 4 экв. 2,4-пентандиона продемонстрировал типичный максимум поглощения енаминона при 318 нм (показан оранжевым цветом), в то время как неактивные антитела этого не сделали (показаны синим цветом).( B ) Скорость образования енаминона в зависимости от рН. Образование энаминона между антителом 40F12 и 2,4-пентандионом отслеживали спектрофотометрически при 318 нм при 22°С. Инкубационные смеси содержали 15 мкМ сайтов связывания антител и 50 мкМ 2,4-пентандиона в цитрат-фосфатном буфере в диапазоне рН от 5,0 до 8,6. Скорости реакций рассчитаны с использованием экспериментально определенного коэффициента экстинкции ε ₃₁₈ = 17,4 мМ ^-1 ⋅см ^-1 .

Таблица 1

Кинетические параметры катализируемых антителами альдольных и ретро- -альдольных реакций

Анализ последовательности.

Для изучения альдолазных антител на уровне генов и белковых последовательностей были клонированы их кДНК и охарактеризованы экспрессированные белки. Выравнивание белковых последовательностей альдолазного антитела показывает, что два антитела 38C2 и 33F12, полученные путем иммунизации гаптеном 1 , являются высоко гомологичными, содержат одинаковую последовательность CDR3 V _H и, следовательно, происходят из одного и того же антитела зародышевой линии.Они отличаются друг от друга 10 аминокислотными заменами у V _L и 9 у V _H вследствие соматической мутации (рис. 3) (2). Аналогично, аминокислотные последовательности двух антител 40F12 и 42F1, полученных при иммунизации гаптенами 2 , являются высоко гомологичными и отличаются друг от друга только в 3 положениях в V _L и в 2 положениях в V _H . Они тоже являются соматическими вариантами друг друга. При сравнении последовательностей этих двух наборов антител становится очевидным, что все антитела имеют высокую степень гомологии в своих генных сегментах V _H .Поиски в доступных базах данных, включая базу данных IMGT (13), позволяют предположить, что тяжелые цепи обоих наборов антител могут быть получены из одного и того же гена зародышевой линии, поскольку их последовательности нуклеиновых кислот оказались наиболее гомологичными V _H 22. 1. сегмент (рис. 3). Поскольку база данных репертуара зародышевой линии мышей неполна, мы не можем без дополнительного клонирования исключить существование другого более гомологичного гена V _H . Хотя составляющие их генные сегменты V _H являются высоко гомологичными, два набора антител используют очень разные области CDR3 V _H для распознавания антигена.В семействе 40F12/42F1 используется сегмент h4, который на пять аминокислот длиннее, чем в семействе 33F12/38C2. В отличие от гомологии сегментов V _H , последовательности легкой цепи V _L двух наборов антител сильно различаются и происходят из разных генов зародышевой линии.

Рисунок 3

Выравнивание аминокислотной последовательности антител к альдолазе. Указаны каркасные области (FR) и области, определяющие комплементарность (CDR). Штрихи обозначают идентичные аминокислоты.В отличие от последовательностей V _L , последовательности V _H четырех антител к альдолазе сильно родственны. Скрининг банка данных показал, что V _H 22.1 является наиболее близким родственным геном зародышевой линии.

Консервативный и химически активный лизин.

Предыдущие исследования антител 33F12 и 38C2 показали, что эти антитела используют каталитический механизм, аналогичный природным ферментам альдолазам I класса (1–3). В этом механизме ε-аминогруппа остатка лизина, находящегося в активном центре, действует как нуклеофил с образованием енамина с донорным кетоновым субстратом, а последующая реакция с акцепторным альдегидным субстратом обеспечивает после гидролиза имина образование альдольного товар.Кристаллическая структура 33F12 (2) показала, что Lys 93 тяжелой цепи [нумерация согласно Kabat (13)] вносит вклад в наиболее подходящую каталитическую ε-аминогруппу для кармана связывания антитела. Поразительно, но лизин H93 консервативен во всех четырех последовательностях антител, хотя этот остаток чаще всего консервативен в виде аланина. Лизин в положении H93 очень необычен и встречается только в 11 известных последовательностях антител (14). Сравнение с предполагаемым остатком зародышевой линии в этом положении показывает, что появление лизина является результатом соматической мутации, поскольку ни один из известных сегментов зародышевой линии V _H не кодирует лизин в этом положении.

Чтобы ε-аминогруппа Lys была нуклеофильной, она должна быть незаряженной. Однако pK _a ε-аминогруппы свободной аминокислоты лизина в водном растворе составляет 10,5 (15). Поскольку каталитическая активность зависит от непротонированного лизина как нуклеофила, а альдолазы действуют с максимальной активностью при нейтральном pH, когда ε-аминогруппа лизина обычно протонирована, pK _и этой группы должны быть нарушены. Чтобы приблизить pK _a основного лизина, мы использовали кинетический анализ, основанный на способности антител образовывать енамины с β-дикетонами.Мы исследовали реакцию 2,4-пентандиона с антителом 40F12 и спектрофотометрически отслеживали поглощение комплекса антитело-енамин при 318 нм. Зависимость этой реакции от pH показана и описана простой кривой титрования с pK _a , равной 6,0 для 40F12 (рис. 2 B ). Предыдущие исследования антител 33F12 и 38C2 выявили pK _a s 5,5 и 6,0 соответственно для их реактивных лизинов (2). Зависимость к _кат / К _М в зависимости от рН для ретро -альдольной реакции также показала кислую ветвь рК _а = 6.3–6,9 для семейства альдольных антител. Этот результат аппроксимирует рН-зависимость катализа FDP-альдолазы (16). Таким образом, альдольные антитела обнаруживают химически активную аминогруппу с сильно нарушенным pK _a в своих активных центрах.

Мутационные исследования.

Для подтверждения идентичности химически активного лизина в положении H93 были проведены исследования сайт-направленного мутагенеза антител 33F12 и 40F12. Были сконструированы два мутанта, в которых Lys ^H93 был заменен на Ala. Для эффективной экспрессии антител вариабельные домены клонировали в вектор экспрессии млекопитающего, в котором тяжелая и легкая цепи экспрессировались с двух промоторов CMV, чтобы получить гибридное антитело IgG ₁ с константной областью каппа человека и константой γ1 человека. региона (CR и CFB, неопубликованные данные). Антитела экспрессировали в линии клеток человека и секретировали в среду для культивирования клеток, из которой их очищали с помощью аффинной хроматографии с белком А.Последующий анализ каталитической активности мутантов и гибридных антител дикого типа проводили с использованием метода альдольного сенсора, который при каталитической конверсии дает флуоресцентный продукт. Эта ретро -альдольная реакция была использована, потому что ее флуоресцентное считывание является наиболее чувствительным индикатором каталитической активности альдолазы (8). Анализ рекомбинантных 33F12 и 40F12 показал, что они сохраняют каталитическую активность антитела, экспрессируемого гибридомой. Однако соответствующие Lys ^H93 →Ala мутанты этих антител показали полную потерю каталитической активности.Эти результаты демонстрируют функциональное значение этого остатка в обоих семействах антител. Хотя структурные изменения трудно исключить, замена лизина на аланин, скорее всего, допустима в этом положении, потому что аланин является аминокислотой, наиболее часто встречающейся в этом положении. Исследования связывания ELISA мутантов Lys ^H93 → Ala с гаптенами 1 и 2 показали, что их специфическое связывание с любым из этих дикетонов было отменено.Все экспрессируемые гибридомой и рекомбинантные антитела к альдолазе связывали оба гаптена с высокой аффинностью. Таким образом, эти результаты подразумевают, что потеря активности у мутантов Lys ^H93 → Ala, скорее всего, вызвана заменой остатка, необходимого для включения дикетонов в ковалентную енаминоновую связь, что согласуется с представлением о том, что этот остаток является ключевой каталитический лизин.

Гомология активных центров антител к альдолазе и природного фермента альдолазы.

В предыдущих исследованиях мы сообщали о кристаллической структуре антитела 33F12 и анализе его активного центра. Чтобы получить представление об активном сайте антитела 40F12, мы построили модель антитела путем сравнения последовательностей 40F12 с нашей базой данных известных структур Fab. Кристаллическая структура 33F12 и модель гомологии 40F12 показывают реактивный лизин на дне глубокого гидрофобного связывающего кармана (рис. 4 A и B ) (2).В 33F12 и 40F12 большинство остатков в радиусе 5 Å от ε-аминогруппы лизина H93 являются гидрофобными (табл. 2). Кроме того, подавляющее большинство этих остатков кодируется в сегменте гена зародышевой линии V _H 22.1, и только His ^h45 в антителах 40F12 и 42F1 является результатом соматической гипермутации. Доминирующая роль сегмента V _H в формировании сайтов связывания этих антител вокруг критического лизина объясняет способность этих двух семейств антител выполнять одну и ту же каталитическую задачу при использовании очень разных легких цепей. Сходная архитектура сайтов связывания антител в двух семействах антител предполагает, что эти альдолазы функционируют посредством аналогичных каталитических механизмов с использованием Lys ^H93 в качестве нуклеофила. Таким образом, pK _a ε-аминогруппы этого остатка лизина, скорее всего, нарушена гидрофобной средой сайтов связывания, присутствующих в обоих семействах антител, как мы первоначально предполагали для антитела 33F12 (2). Это гидрофобное микроокружение препятствует протонированию и развитию заряда на ɛ-аминогруппе Lys ^H93 , тем самым снижая его pK _a .Чтобы изучить взаимосвязь наших альдолаз антител с их аналогами природных ферментов, мы исследовали кристаллические структуры природных ферментов альдолазы. Анализ рентгеновской структуры N -ацетилнейраминалиазы выявил глубокий карман, который, как предполагается, является активным центром фермента (17). В этом ферменте Lys165 находится на дне кармана активного центра в гидрофобной среде (рис. 4 C ) и, как было предсказано, является ключевым остатком лизина в каталитическом механизме этой альдолазы.Как и в случае с нашими антителами к альдолазе, гидрофобное микроокружение может быть ответственным за настройку pK _a ε-аминогруппы этого остатка лизина. Однако большинство природных ферментов альдолазы, по-видимому, используют электростатический механизм для нарушения pK _a ε-аминогруппы лизина. Этот механизм был впервые предложен Вестхеймером в его исследованиях другого аминозависимого фермента, ацетоацетатдекарбоксилазы (ссылка 18 и ссылки в ней). Множественные остатки лизина наблюдаются в активных центрах различных фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаз класса I, что позволяет предположить, что электростатика может объяснить повышенную реактивность ключевого остатка лизина в этом распространенном гликолитическом ферменте.В альдолазе мышц кролика (19) расстояние между ε-аминогруппами Lys229 и Lys146 составляет 4,9 Å. (Фиг. 4 D ), что сравнимо с таковым, наблюдаемым для манделатрацемазы (20), в которой электростатические эффекты также считаются критическими в возмущении pK _a ключевой ε-аминогруппы. Сравнение боковых цепей, присутствующих в радиусе 5 Å от аминогруппы активного центра, показывает радикальные различия в типах боковых цепей, обнаруживаемых в активных центрах ферментов, использующих либо гидрофобный, либо электростатический механизм для лизина pK _a возмущение. .

Рисунок 4

Сравнение активных центров альдолазы абзима и фермента. Все помеченные боковые цепи находятся в пределах 5 Å от каталитической группы лизина (синяя) Nɛ. ( A ) Вид сверху на сайт комбинирования Fab’ 33F12. ( B ) Тот же вид для гомологической модели 40F12. ( C ) Вид активного центра N -ацетилнейраминалиазы (17) вокруг Nɛ каталитического остатка лизина 165. ( D ) Тот же вид активного центра фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы (19) вокруг Nɛ каталитического остатка лизина 229.Рисунок был сгенерирован с пониманием (Biosym Technologies).

Таблица 2

Остатки в пределах 5 Å от группы Nɛ каталитического лизина (выделены жирным шрифтом)

Выводы

Образование антител — это эволюционный процесс, который выбирает энергию связывания. Если сравнить то, как генерируются новые функции в биологии в целом, с тем, что происходит в иммунной системе, можно обнаружить много общего. В каждом случае генотипические параметры, которые генерируют новую информацию, связаны с системой отбора.Основные отличия заключаются в параметрах выбора и временной шкале. Общая эволюция использует естественный отбор для отбора функций в течение длительного времени, тогда как иммунная система использует клональный отбор для отбора на улучшение энергии связывания антител в течение нескольких недель. Реактивная иммунизация позволяет переключить параметры селекции иммунной системы на параметры, более близкие к естественному отбору, сохраняя при этом благоприятный временной ряд индукции антител. Одна интересная особенность этих экспериментов заключается в том, что из-за пороговых соображений не было никакой гарантии, что, даже если системе будет предложена возможность выполнить сложную химию, этот параметр будет выбираемым.Например, в описанных здесь экспериментах система была настроена так, чтобы система могла двигаться к образованию ковалентной связи, что является «конечным» достижением энергии связи. Однако, если бы порог для клеточного деления и дифференцировки был намного ниже, это редкое явление могло бы никогда не наблюдаться. Например, если простое нековалентное связывание с бензольным кольцом в антигене давало достаточную энергию связывания для размножения клонов, эта особенность становится событием отбора без какой-либо движущей силы в сторону более сложной химии, необходимой для катализа альдольной реакции.Тем не менее, высокий процент клонов достигает способности образовывать ковалентную связь; следовательно, система, разработанная для простого связывания, может сделать гораздо больше, когда параметры выбора изменены. Помимо эволюции катализа, иммунная система должна иметь истинное эволюционное стремление к связыванию энергии, и когда предлагаются более совершенные пути для достижения этой цели, ими можно воспользоваться.

Наши исследования дают картину эволюционных событий, которые привели к каталитическому механизму и неразборчивости субстрата, наблюдаемым для этого семейства катализаторов. В обоих эволюционных испытаниях остаток лизина появился на ранней стадии соматического уточнения в антителах зародышевой линии с использованием предполагаемого сегмента зародышевой линии V _H 22.1. Эта зародышевая линия, по-видимому, кодирует глубокий гидрофобный карман. Карман сам по себе не предрасположен к связыванию дикетоновых гаптенов, которые мы изучали здесь, с высокой аффинностью, но единственная соматическая мутация в Lys ^H93 обеспечивает ковалентный химический раствор для связывания с высокой аффинностью. Химическая реактивность, которой обладает Lys ^H93 в этом типе сайта связывания, легко выбирается.Как только появилась эта ковалентная химия, дальнейшего уточнения связывающего кармана не произошло, потому что это не давало селективного преимущества системе. Этот результат дополняет исследования онтогенеза других антител-катализаторов и других гаптен-связывающих антител, в которых используются нековалентные механизмы (21-24). Эти исследования показали, что определенные гены зародышевой линии готовы к катализу определенных реакций или к быстрой эволюции до высокоаффинного связывания гаптена. Таким образом, мы получаем аналогичный результат, когда задействована ковалентная химия, и предполагаем, что ковалентные химические реакции могут быть так же легко выбраны из иммунного репертуара, как и традиционные нековалентные взаимодействия, которые сформировали наши взгляды на иммунохимию.Кроме того, как мы обсуждали ранее (2), мы полагаем, что эти эксперименты повторяют определяющие события в эволюции природных ферментов, особенно в том, что касается химического механизма, каталитической неразборчивости и дупликации генов (25, 26).

Таким образом, одним из ключевых результатов этого исследования является то, что некоторые параметры для альдольных катализаторов являются критическими, тогда как другие являются более вырожденными. Хотя четыре антитела к альдолазе, описанные здесь, имеют один и тот же сегмент зародышевой линии V _H , они демонстрируют очень разные последовательности CDR3 V _H и легкой цепи.Хотя структурные корреляты для ковалентного механизма в этом классе антител в настоящее время определены, структурные корреляты для каталитической эффективности еще предстоит раскрыть. Тем не менее, мы уже знаем, что каталитическая способность альдолаз антител может в некоторых случаях превышать 10 ¹³ (5).

По необходимости наше исследование зависит от химических растворов, разрешенных в каркасе антитела. Возможно, что альтернативные решения могут быть предпочтительнее в других белковых структурах.Например, мы не нашли серьезного решения проблемы лизина pK _— , которую природа чаще всего использует. В большинстве природных альдолаз второй лизин появляется рядом с лизиновым нуклеофилом и изменяет его pK _a за счет электростатических взаимодействий. Возможно, просто этот второй лизин настолько дестабилизирует складку антитела, что ее никогда не видно, или что репертуар зародышевой линии структурно благоприятствует гидрофобному механизму, поскольку он возникает в результате общего использования той же самой зародышевой линии V _H 22.1 сегмент всеми четырьмя антителами. В качестве альтернативы, появление второго лизина может быть более редким событием, и размер нашей выборки мог быть слишком мал, чтобы его наблюдать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом CA27489 (для I.A.W., C.F.B. и R.A.L.) от Национального института здравоохранения и Института химической биологии Скаггса.

Сноски

• ↵* Кому следует направлять запросы на перепечатку.Электронная почта: foleyral{at}scripps.edu или carlos{at}scripps.edu.

• Депонирование данных: последовательности, о которых сообщается в этой статье, были депонированы в базе данных GenBank (номер доступа AF242212–AF242219).

• Принято 27 декабря 1999 г. Обзор

  Дэвид Бадре
  Издательство Принстонского университета
  2020 | 312 стр | 25 фунтов стерлингов
  ISBN 97806
  553

  Купить эту книгу на Amazon.co.uk
  Купить эту книгу на Bookshop.org

  Вы когда-нибудь задумывались, почему так тяжело работать из дома? На задании углубляется в понимание того, как дать вашему мозгу сигналы о работе, которую он должен выполнять, и как улучшить вашу память.

  Дэвид Бадре, профессор когнитивных, лингвистических и психологических наук, описывает, как наш мозг устроен, чтобы распознавать ситуации, выполнять последовательность действий и отвлекаться на определенные раздражители. Он умело сочетает важные исторические эксперименты, раскрывающие ключевые аспекты нашего мыслительного процесса, с простыми для понимания примерами, например, что происходит в нашем мозгу, когда мы пытаемся сделать что-то такое простое, как приготовление чашки кофе.

  Как заядлый цифровой блокнот, который часто испытывает трудности с организацией своих заметок, мне особенно понравились главы о поиске информации. В этих разделах объясняются алгоритмы, которые используют поисковые системы, такие как Google, и то, как они ранжируют информацию в зависимости от ее возможной полезности. Мне также понравилось узнавать, как эти алгоритмы связаны с процессами, происходящими в нашем собственном мозгу каждый раз, когда мы пытаемся вспомнить информацию. Удивительно думать о том, как алгоритмы поисковых систем устроены так, чтобы обрабатывать информацию способами, которые смоделированы по образцу процессов в нашем мозгу.