Рубежное орг юа: Рубежное.org.ua | Новости Украины | UAport

• العربية
• Belarusian
• български
• Breton
• Català
• česky
• Dansk
• Deutsch
• Ελληνικά
• English
• Esperanto
• Español
• Español (Argentina)
• Español (Colombia)
• Español (México)
• Eesti
• Euskara
• suomi
• français
• Français (Canada)
• Galego
• עברית
• magyar
• Indonesia
• Italiano
• 日本語
• ಕನ್ನಡ
• 한국어
• Lëtzebuergesch
• Lietuvių
• Latviešu
• македонски
• मराठी
• Norsk Bokmål
• Nederlands
• Occitan
• Polski
• Portuguese
• Português (Brasil)
• Русский
• Slovenský
• Slovenian
• Shqip
• Svenska
• Thai
• Türkçe
• Українська
• 简体中文
• 繁體中文
• Help Translate!

Уважаемые жители города Рубежное! В преддверии Международного Дня пожилого человека, открытия нового 2018-2019 учебного года в «Университете третьего возраста», КУ «Территориальный центр» проводит конкурс «А ну-ка, бабушки!».

Уважаемые жители города Рубежное!

В преддверии Международного Дня пожилого человека, открытия нового 2018-2019 учебного года в «Университете третьего возраста», КУ «Территориальный центр» проводит конкурс «А ну-ка, бабушки!».

Конкурс включает 6 номинаций:
• визитная карточка;
• бабушка «топ-модель»;
• все для внуков;
• бабушка-кулинар;
• бабушка-артистка;
• бабушка-танцовщица.

Приглашаем принять участие в конкурсе всех желающих, уважаемых, красивых, добрых, веселых, талантливых женщин, которые гордо носят звание – «БАБУШКА».

Для участия в конкурсе, заявки принимаются до 20 сентября 2018 г. в КУ «Территориальный центр», ул. Строителей, 25; каб. №20;
телефон (064 53) 6-43-54.

Приглашаем подопечных КУ «Территориальный центр» и жителей города приятно провести время, посетив вечер отдыха, который будет проходить 28.09.2018 г. в 11-00 часов в малом зале городского КУ «Дворец культуры».

Администрация КУ «Территориальный центр»

Тактика выжженной земли – Парламентская газета

После избрания Петра Порошенко на пост президента страны, первое, о чем он сказал: «Снарядов не жалеть»  и  на Юго-Востоке  началась «настоящая»  антитеррористическая операция. А до этого что было?  Славянск, Краматорск, Мариуполь… Расстрел Новоайдарской избирательной комиссии, расстрел  12 человек  в городе Счастье Луганской области  в день выборов, расстрел блокпоста народного ополчения в станице  Луганской…  Погибли десятки людей.  Дети остались без отцов.  

За  три дня после выборов нового президента  Украины полностью разбит Донецкий аэропорт, из последних сил, но по прежнему мужественно и самоотверженно защищается от артобстрелов Славянск, Артемовск, Краматорск,   28 мая 2014 года, фактически оккупированы  Старобельск и Новоайдар, что под Луганском.  В ночь с    27 на 28 мая, военные силы Украины предприняли повторную попытку захвата города Рубежного в Луганской области.   До выборов президента здесь   уже происходили боевые столкновения, однако ополченцам удалось остановить военных на расстоянии пяти километров от города. Теперь же украинские солдаты   скопили силы и вновь атаковали город, и в этот раз  обстрел вели уже из минометов. В наступлении на город Рубежное принимала участие   военная техника. Наиболее интенсивный огонь  велся  в районе ТЭЦ, которая обеспечивает электричеством практически весь населенный пункт  Из-за повреждения линии электропередачи остановилась насосная станция в близко расположенном городе Кременная,  была прекращена подача воды.

«Только что снимал  Рубежное, и видел, как со стороны Кременной, залпы, выстрелы и ракеты летящие в сторону ТЭЦ. Грохочет так, что дребезжат стекла в квартирах! Обстрелы повторяются каждые 5-10 минут! Да кто же остановит этих маразматиков? Я даже не могу представить как там себя чувствуют люди, которые живут в районе Ленёва! Слышу, что грохот снова продолжается! Только что видел, как был артиллерийский выстрел и что-то загорелось в районе Старой Краснянки Кременского района Луганской области», –  написал пользователь TimonWizard на сайте города Рубежное (rubezhnoe.org.ua).

И это — только начало. Остановлена работа предприятий, досрочно отпущены на каникулы школьники, мэрия соседнего с Рубежным городаЛисичанска готовит жителей к эвакуации. Всё идет к тому, что очень скоро будет парализована жизнь и деятельность крупнейшего промышленного района Луганщины — Рубежное, Лисичанск, Северодонецк. А это — шахты «Лисичанскуголь», объединение «Азот», Лисичанский нефтеперерабатывающий завод, десятки других предприятий. Это — не только продукция, но и тысячи рабочих мест. Хотя вопросы как будут жить эти рабочие и их семьи меньше всего интересуют сегодняшнюю украинскую власть, которая по отношению к своему народу выбрала  тактику выжженной земли.

Любовь Корсакова

Справка

Любовь Александровна Корсакова — журналист, общественный деятель.

С 2006 года –  Учредитель, главный  редакторй Луганской областной независимой общественно-политической газеты «ВОСХОД»

В  марте 2005 года   была избрана депутатом Луганского областного совета.  

С ноября 2013 года  активист  общественной организации «Луганская  гвардия».  Инициатор и координатор проведения первого референдума в Луганской области 16 марта 2014 года, инициатор, организатор и координатор первого антифашистского съезда Юго-Восточных регионов Украины, состоявшегося в Донецке 26 апреля 2014 года.

За свою активную гражданскую позицию была подвержена гонениям со стороны украинской власти и в настоящее время вместе с семьей, вынуждена скрываться на территории Российской Федерации.

Возрождение Китая и международная политическая экономия на JSTOR

Нет никаких сомнений в том, что международное возрождение Китая представляет собой одно из самых значительных событий в современной истории. По мере того как политическая экономия Китая приобретает все большее значение, его взаимодействие с другими крупными политическими экономиками будет формировать глобальные ценности, институты и политику, тем самым реструктурируя международную политическую экономию. Опираясь на теории и концепции сравнительного капитализма, автор рассматривает возрождение Китая как порождение китайского капитализма – капиталистической системы, уже имеющей глобальный охват, но отличающейся от англо-американского капитализма во многих важных отношениях. Китайско-капитализм больше полагается на неформальные деловые сети, чем на правовые кодексы и прозрачные правила. Он также отводит китайскому государству ведущую роль в стимулировании капиталистического накопления и управлении им. В конечном счете, китайско-капиталистический разум способствует меньшему доверию к свободным рынкам и большему доверию к унитарному государственному правлению и социальным нормам взаимности, стабильности и иерархии. После концептуализации внутренней политической экономии китайского капитализма автор использует пример попыток Китая интернационализировать свою валюту, юань или юань, чтобы систематически проиллюстрировать многообразие способов, в которых внутренняя логика китайского капитализма выражается на глобальном уровне.Вместо того чтобы выдвигать детерминистский аргумент относительно будущей международной роли Китая, он утверждает, что позиция и стратегия Китая в международной политической экономии довольно тесно связаны с гибридными компенсационными институциональными механизмами китайско-капитализма на внутреннем уровне: руководство государства; гибкие и предпринимательские сети; и глобальная интеграция. Таким образом, китайско-капитализм представляет собой зарождающуюся систему глобального капитализма с центром в Китае, которая создает динамическое сочетание взаимной зависимости, симбиоза, конкуренции и трений с все еще доминирующей англо-американской моделью капитализма.

World Politics, основанный в 1948 году, является всемирно известным ежеквартальным политологическим журналом, публикуемым как в печатной, так и в электронной версии. Открытый для вкладов ученых, World Politics предлагает присылать исследовательские статьи, которые вносят теоретический и эмпирический вклад в литературу, а также обзорные статьи, касающиеся проблем международных отношений и сравнительной политики.

Cambridge University Press (www.cambridge.org) – издательское подразделение Кембриджского университета, одного из ведущих исследовательских институтов мира, лауреата 81 Нобелевской премии. В соответствии со своим уставом издательство Cambridge University Press стремится максимально широко распространять знания по всему миру. Он издает более 2500 книг в год для распространения в более чем 200 странах. Cambridge Journals издает более 250 рецензируемых научных журналов по широкому спектру предметных областей в печатных и онлайн-версиях. Многие из этих журналов являются ведущими научными публикациями в своих областях, и вместе они составляют одну из наиболее ценных и всеобъемлющих областей исследований, доступных сегодня.Для получения дополнительной информации посетите http://journals.cambridge.org.

Зион Юа, Проекты жилищного строительства в Мексике

В прошлый вторник мы получили известие от Зиона Юа, коллеги Дмитрия по работе в Thurber Engineering. Зион – молодой инженер-гео-эколог, который любит помогать другим. Он верит, что к проблемам нужно подходить в первую очередь действием. Он сказал, что молодые люди двадцатилетнего возраста очень ограничены во времени, поскольку они заняты своей карьерой и жизнью. Когда они решают взять на себя обязательство помогать другим, им нравится иметь возможность действительно изменить ситуацию и одновременно узнавать о других людях и местах.

Приверженность Сиона делу помощи другим началась в средней школе в Чилливаке, Британская Колумбия, когда он решил собрать группу друзей, чтобы помочь другим людям в местном сообществе. В 2011 году, когда в Японии произошло землетрясение в Тохоку, он решил, что ему нужно пойти и помочь там. После этого он провел несколько недель, помогая убирать мусор, и в процессе он встретил людей со всего мира, которые только что решили подобрать и прийти сами, чтобы помочь каким-то образом.

Это вдохновило его, когда он вернулся в Канаду, чтобы вместе с группой друзей найти проект, в котором они все могли бы помочь. Он услышал от одного из этих друзей о возможностях построить дома для людей в долине Сан-Квентин в Нижней Мексике. Большинство людей здесь – потомки рабочих-мигрантов из Уахаки, которые приехали работать на овощные и фруктовые фермы региона. Их жилищные условия очень плохие, обычно нет водопровода или электричества, и их дома часто строятся из того, что есть под рукой, например, упаковочных ящиков, картона, листов и пластика, скрепленных ремнями или веревками.Они работают в поле и обычно зарабатывают около девяти долларов США в день. К сожалению, другие расходы, такие как школьная форма для их детей, обходятся в сто долларов в год, и детям не разрешается посещать школу без них.

Эти проекты строительства домов выполняются разными группами. Он и его друзья решили стать партнером организации «Молодежь с миссией» (YWAM), чтобы помочь построить дома для двух семей в 2016 году, а также в 2017 году. Им необходимо будет собрать средства для покрытия стоимости строительных материалов и других принадлежностей, помимо личных покрытие собственных расходов на проезд и проживание.Поскольку ни он, ни его друзья ничего не знали о строительстве домов, они научились строить каркас и кровлю, просматривая видео в YouTube. В августе 2016 года они отправились в Баху и построили два дома. Они должны были на практике научиться пользоваться такими столярными инструментами, как молотки, рулетки и пилы. Дома были очень простыми, двадцать на двадцать два фута, с деревянными каркасами, построенными на бетонной плите, с рулонной кровлей наверху. Они построили столы и двухъярусные кровати, а также предоставили матрасы, столы и новые пристройки.В домах до сих пор нет водопровода и электричества, поскольку их нет в районе, где они находятся. Кроме того, они предоставили детям школьную форму. В 2017 году они вернулись и построили еще два дома для еще двух семей.

Он сказал, что он и его друзья теперь ищут другую возможность помочь другим и рассматривают несколько различных проектов, в которых они могли бы помочь. Для нашей группы было воодушевлено услышать об этой небольшой группе друзей, которые самостоятельно взяли на себя обязательство посвятить время и деньги помощи другим.

Транспортировка молоди лосося мешает взрослой особи mi

Ученые обнаружили, что меры управления, направленные на содействие миграции лосося и стальной форели, могут иметь непредвиденные последствия для популяций рыб. Молодь, которую перевозят вниз по течению на лодках, может потерять способность мигрировать обратно в места размножения, что снижает их выживаемость и изменяет адаптацию в дикой природе.

Транспортные программы осуществляются уже более трех десятилетий для улучшения выживаемости рыб, которые вылупляются в реках, но мигрируют вниз по течению в океан, где они живут большую часть своей взрослой жизни.Затем взрослые плывут обратно вверх по реке, чтобы спариваться, откладывать яйца и, наконец, умирают в том же месте, где они родились. Эти рыбы могут путешествовать на сотни миль и совершать впечатляющие восхождения по водопадам и мимо плотин.

Однако, когда плотины перекрывают реки, мигрирующим рыбам, особенно молоди, может быть трудно перемещаться между их нерестилищами и открытым океаном.

«Молодые особи, пытающиеся вернуться в море, обычно проходят через водосбросы или мимо турбин плотины», – говорит Мэтью Кифер, биолог из Университета Айдахо и ведущий автор исследования, опубликованного в ноябрьском выпуске журнала Ecological Applications. .

Однако прохождение турбин плотины может убить много молоди рыбы. В ответ меры управления помогают лососю и стальной форели полностью избегать плотин, перевозя молодь мимо плотин к океану на речных баржах.

Но Кифер обнаружил, что эта бесплатная поездка на пароме может создать проблемы, когда подростки вырастут. Он и его коллеги Кристофер Кодилл, Кристофер Пири и Стивен Ли из Университета Айдахо проследили закономерности передвижения взрослой особи лосося и стальной форели вдоль рек Колумбия и Снейк в Вашингтоне и Орегоне.Они обнаружили, что по сравнению с рыбами, которые мигрировали естественным путем, транспортированная молодь имела более низкую выживаемость во взрослом возрасте и с меньшей вероятностью вернулась домой.

«Взрослые рыбы обычно неуклонно движутся вверх по течению к своим нерестилищам, но некоторые вместо этого возвращаются вниз по течению через плотины», – говорит Кифер. Это явление, которое менеджеры рыболовства называют запасным, чаще встречается у взрослых особей, которые были выгнаны в молодости, чем у тех, кто мигрировал естественным путем.

«Непонятно, просто ли у них заканчивается пар, плывя вверх по реке, или они дезориентируются и возвращаются вниз по течению в поисках сигналов от своей родной реки», – говорит Кифер.

Ученые считают, что нахождение на барже не позволяет молодым рыбам узнавать важные экологические сигналы в период становления их молоди. По словам Кифера, баржа может преодолеть такое же расстояние за два-три дня, что обычно занимает несколько недель. Путешествие на большие расстояния на лодке – в этом исследовании – не менее 215 миль – похоже, искажает естественные сигналы, которые эти рыбы используют, чтобы найти дорогу домой. Результаты Кифера также предполагают, что перевозимая рыба с большей вероятностью отклонится от родного притока. Если эта потерянная рыба – часто из заводских популяций – размножается с другой дикой популяцией, результирующий поток генов может снизить эволюционную пригодность этой популяции.

«История жизни лосося представляет собой долгое наследие адаптации к местным условиям», – говорит Кифер. «Рыбы хорошо приспособлены к определенным рекам, и если разбавить их уникальный генетический состав, это может снизить продуктивность всей популяции».

По словам Кифера, трудно найти удовлетворительное решение.Управляющие могут выгружать меньше молоди, но тогда больше рыбы погибнет при попытке пройти через плотины. Они также могли бы сбрасывать больше воды через водосбросы плотин, чтобы помочь молоди пройти вниз по течению, но это уменьшило бы количество энергии, производимой плотинами. Третий вариант – замедлить движение барж, чтобы поездка напоминала время, необходимое молодым людям, чтобы доплыть до океана. Но лодки представляют собой стрессовую среду для рыб, а близкое расположение судов увеличивает риск заболеваний.

«Трудно найти решение, которое могло бы справиться со всеми проблемами в этой системе», – говорит Кифер.Ученые и менеджеры по выращиванию лосося надеются найти идеальное решение: такое, которое сохранит местные популяции рыб и максимизирует их выживание при сохранении целостности энергопроизводящих плотин.

###

Чтобы получить доступ к изображениям, связанным с этой статьей, свяжитесь с Кристин Бакли по адресу [email protected] или по телефону (202) 833-8773 доб. 211.

Экологическое общество Америки – крупнейшая в мире профессиональная организация экологов, представляющая 10 000 ученых в Соединенных Штатах и ​​по всему миру.С момента своего основания в 1915 году ЕКА продвигает ответственное применение экологических принципов к решению экологических проблем с помощью отчетов, журналов, исследований и экспертных заключений Конгресса ЕКА. ЕКА издает четыре журнала и ежегодно созывает научную конференцию. Посетите веб-сайт ESA http://www.esa.org.

Журнал

Экологические приложения

Заявление об отказе от ответственности: AAAS и EurekAlert! не несут ответственности за точность выпусков новостей, размещенных на EurekAlert! участвующими учреждениями или для использования любой информации через систему EurekAlert.

Д-р Юань Чжао | Business School

80908236

% PDF-1.4 % 1 0 объект > эндобдж 4 0 obj > поток 2021-10-18T03: 42: 26-07: 002020-03-13T19: 34: 05-07: 002021-10-18T03: 42: 26-07: 00Appligent AppendPDF Pro 5. 5uuid: 04a7554f-ade6-11b2-0a00- 782dad000000uuid: 7f0c8874-1dd2-11b2-0a00-d30078bdcbffapplication / pdf

Величайшая китайская балерина всех времен: Юань Юань Тан –

Выставка #DancerDose на этой неделе посвящена китайской балерине и иконе моды Юань Юань Тан. Достижения Тан, названные «величайшей китайской балериной всех времен» и «национальным достоянием», – это то, к чему мы все должны стремиться.

Рожденные в балетных туфлях

Юань Юань Тан родился в Шанхае, Китай, и впервые научился танцевать в дошкольных учреждениях. В балет она влюбилась после просмотра трансляции Галины Улановой в программе «Лебединое озеро» . Когда ей было 10 лет, она попала в шанхайскую балетную школу и начала свое первое обучение балету. Она была одной из 24 танцоров, которым выпала честь тренироваться на этой престижной программе. Ее отец, однако, не видел ценности в ее занятиях балетом и хотел, чтобы она продолжила учебу и получила степень доктора медицины или права.Однако ее мать очень поддерживала желание Тана стать балериной. В конце концов, они подбросили монету в 5 фенов, чтобы решить. Жеребьевка выиграла мать Тана, и через год Тана разрешили поступить в школу.

Источник: https://news.cgtn.com/news/334d7a4e35637a6333566d54/share_p.html

Школьное время побед

Она пошла в школу, когда ей было 11 лет. Из-за того, что она пошла на год позже, она отстала в классе. В течение 2 лет Тан была в депрессии и тосковала по дому, желая уйти из программы, пока не пришла новая учительница и не разожгла ее любовь к танцам.Когда Тан было 14 лет, она начала участвовать в международных балетных конкурсах.

Источник: https://liams-annie-leibovitz-photos.tumblr.com/post/92287100702/yuan-yuan-tan-by-annie-leibovitz-for-russian-vogue

Ее первая крупная победа была на 5 ^{-м Международном конкурсе артистов балета} в Париже, Франция, в 1992 году. Она была отмечена высшим баллом от своего кумира и легендарной балерины Галины Улановой. Она выиграла золотую медаль в юниорском дивизионе в Париже, а также на Японском международном конкурсе балета и современного танца 1 ^st год спустя в Нагое, Япония.В Японии она также была удостоена премии Нижинского, названной в честь легенды русского балета Вацлава Нижинского. Тан, получивший эту награду, впервые был вручен танцовщице.

Школа профессионального мастерства

В 1994 году Тан оставила школу в Шанхае и начала обучение по методу Вагановеа на полную стипендию в школе Джона Кранко в Штутгарте, Германия. Однако Тан не смогла завершить двухлетнюю стипендиальную программу. Всего через полгода к ней обратился художественный руководитель балета Сан-Франциско.Они пригласили ее танцевать с труппой.

Tan приехала в Сан-Франциско в 1995 году в возрасте 17 лет. Ей быстро предложили постоянный контракт солистки, и она стала самой молодой солисткой, а также первой азиатской солисткой. Ее первая крупная роль была в балете «Лебединое озеро », балете, который изначально вдохновил ее!

Быстрое исследование

Источник: http://www.cityballetschool.org/news1/2016/6/27/shanghai-students-and-yuan-yuan-tan-visit-city-ballet-school

Одним из главных достижений Тан является тот факт, что она в последнюю минуту заменила ведущего танцора в Стравинском Концерт для скрипки .Тан никогда раньше не танцевала этот балет и не знала этот стиль хореографии. Ей дали посмотреть видеокассету, и она исполнила танец только через 6 часов. Год спустя, в 19 лет, они сделали Тана ведущим танцором. Она снова была самым молодым руководителем в истории баллера Сан-Франциско и первой китайской танцовщицей, достигшей этого рейтинга.

Впечатляющее резюме

С тех пор она сыграла главную женскую роль в фильмах «Жизель», «Лебединое озеро», «Ромео и Джульетта», «Щелкунчик», «Дон Кихот», «Сильвия», «» и « Отелло». А также роли в фильмах Томассона Пятый сезон , Chi-Lin , Silver Ladders и 7 for Eight , и это лишь некоторые из них. Помимо того, что она сотрудничает с такими брендами одежды, как Burberry, Chanel, Coach, Dior, Giorgio Armani, Louis Vuitton и Tiffany & Co., она также публиковалась в таких журналах, как Time, Vogue, W, Elle China, Elle UK. и Cosmopolitan . И снимался в фильмах и телешоу.

Тан – легендарная артистка балета в истории и идеальный выбор для нашего блога #DancerDose на этой неделе. Она олицетворяет то, на что повсюду должны смотреть дети и танцоры, как на того, кто стремится отличаться от других и творить историю.

Знаете ли вы эффектного танцора, которого мы должны показать?

Эл. Почта [email protected] имя танцора и почему вы думаете, что оно должно быть указано!

Алисса Дентон – писатель StarQuest.Она любит Дисней, латте со льдом и картофель фри!

Метаболомический анализ с высоким охватом выявляет фагоспецифические изменения физиологии Pseudomonas aeruginosa во время инфекции

Отобранные фаги

Чтобы исследовать возникновение фагоспецифических эффектов на метаболизм хозяина, мы направлен на выбор фагов с возможно различными фенотипами инфекции.Чтобы проиллюстрировать это, мы построили сеть популяций вирусов, которая включает известные (литические) фаги Pseudomonas , на основе сходства белковых последовательностей с использованием базы данных ACLAME. Выбранные фаги: LUZ19, LUZ24, PEV2, 14-1, phiKZ и YuA представляют разные ответвления в этой сети (рис. 1). Фаги PEV2 и phiKZ ограничены двумя компонентами, соответствующими N4- и phiKZ-родственным группам, соответственно; отделены от самого большого связного компонента. Эти отдельные компоненты, приписываемые их отдельным общим ядерным белкам, подтверждают таксономические описания как отдельные эволюционные ветви.Кроме того, фаги LUZ24, 14-1 и LUZ19 попадают в взаимосвязанные области, включающие 7 LUZ24-подобных фагов, 13 PB1-подобных фагов и 3 phiKMV-подобных фага в кладе Autographivirinae , соответственно. Каждый регион содержит одну или несколько фаговых групп, что указывает на их тесные эволюционные отношения. YuA разделяет белки с несколькими группами, причем M6 является его ближайшим родственником. В совокупности, поскольку эти фаги принадлежат к отдельным родам, шесть изученных фагов обеспечивают важную основу для понимания разнообразия фагов Pseudomonas в различных вирусных линиях. Таблица 1 также показывает, что эти фаги сильно различаются по размеру генома, содержанию GC и продолжительности цикла заражения.

Популяционная сеть вирусов выявляет отдельные кластеры во вселенной фага Pseudomonas . Сеть состоит из 498 фагов, принадлежащих Myoviridae , Siphoviridae , Podoviridae или не охарактеризованных и других фагов, и 6953 взаимосвязей между ними. Узлы в сети связаны ребрами, указывающими на значимые отношения между вирусами с точки зрения общего содержания генов (белков).Показаны вирусы с показателем строгости подобия ≥1, который оценивается по гипергеометрической формуле. Сеть была визуализирована с помощью встроенного пружинного макета с взвешиванием по краям с использованием программной платформы Cytoscape (версия 3.1.1), которая помещает вирусные геномы, имеющие больше семейств белков, ближе к дисплею. Выбранные фаги обведены кружком и названы жирным шрифтом. Оранжевый = Myoviridae , бирюзовый = Siphoviridae , фиолетовый = Podoviridae , серый = не охарактеризован.

Инфекция фагом нарушает стабильное состояние метаболизма в экспоненциально растущих клетках

Чтобы изучить динамический ответ метаболизма хозяина на инфекцию различными фагами, мы провели временной эксперимент, заразив P. aeruginosa каждым из шести выбранных фаги и отбор образцов метаболического содержимого на разных стадиях заражения. Чтобы гарантировать синхронизированное инфицирование и однородность образца во время эксперимента, была скорректирована MOI и построены кривые гибели для отдельных фагов, чтобы подтвердить синхронизированную инфекцию (дополнительный рисунок S1, материалы и методы).Образцы были проанализированы с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с нецелевым впрыском потока, что позволило проводить измерения метаболома с высоким охватом. Всего было обнаружено 6006 ионов, из которых 918 можно отнести к метаболитам P. aeruginosa . После строгой фильтрации ионных аддуктов было сохранено 375 уникальных ионов, соответствующих 518 метаболитам, включая массовые изомеры.

Для сравнения динамики метаболитов были определены кратные изменения метаболитов для каждой временной точки относительно нулевой временной точки каждой инфекции.Без инфекции уровни метаболитов оставались стабильными, действительно, только небольшая часть метаболитов (3,2%) показала (небольшое) увеличение через 45 минут (log2 (кратное изменение) <0,5) (рис. 2а). По сравнению со стабильным метаболическим состоянием неинфицированных образцов, фаговая инфекция вызвала значительные изменения (значение P ≤0,05 и абс (log2 (кратное изменение)> 0,5) до 24,5% обнаруженных метаболитов. , как сумма увеличения (19,7%) и уменьшения (4,8%) метаболитов (PEV2, 25 мин после заражения, рис. 2a).Это согласуется с результатами, наблюдаемыми для инфекции литического розеофага (Φ2047B) у Sulfitobacter sp. 2047, где примерно 25% из 82 измеренных метаболитов были изменены после одного цикла заражения (60–120 мин; Ankrah et al., 2014), подтверждая, что физиология хозяина значительно изменяется при заражении фагом в различных системах хозяина.

(a) Процент измененных метаболитов Pseudomonas в ходе инфицирования P.aeruginosa с шестью различными кладами фагов ( P – значение ≤0,05 и log ₂ (кратное изменение) ≤ −0,5 или ≥0,5). Кратковременные изменения определяли путем сравнения уровней метаболитов до инфицирования с указанным моментом времени во время инфицирования. ( b) Процент метаболитов, измененных при множественных фаговых инфекциях, метаболиты считались значительно измененными, когда значение P ≤0,05 и log ₂ (кратное изменение) ≤ −0,5 или ≥0,5.

«Универсальный» метаболический ответ хозяина на фаговую инфекцию

Для выявления потенциально общих метаболических ответов на фаговую инфекцию сравнивали изменения всех аннотированных метаболитов между различными фагами.В общей сложности 56% метаболитов были значительно изменены как минимум одним фагом (значение P <0,05 и абс (log2 (кратное изменение)> 0,5). Однако только 2,4% метаболитов были изменены при заражении каждым из них. из шести фагов, что указывает на отсутствие общего ответа на фаговую инфекцию (Рисунок 2b). Напротив, было обнаружено, что 17,30% метаболитов были значительно увеличены / уменьшены одним фагом, в то время как оставались стабильными во всех остальных (Рисунок 2b). , Дополнительная таблица S1).

Небольшой процент изменяющихся метаболитов (2,4%, девять метаболитов), общих для всех фагов, участвует в метаболизме нуклеотидов и нуклеотидных сахаров (дополнительная таблица S2). Метаболизм нуклеотидов производит необходимые нуклеотиды для репликации вирусного генома, что, как было показано, имеет решающее значение во время инфекции Т7 (Qimron et al., 2006). UDP-глюкоза и UDP-галактоза являются ключевыми промежуточными продуктами для производства олиго- и полисахаридов (Bosco et al., 2009; Ebrecht et al., 2015). Например, нуклеотидные сахара (UDP-глюкоза, UDP-альфа-D-ManNAc3NAcA и UDP-альфа-D-GlcNAc3NAcA) являются предшественниками для биосинтеза липополисахаридов (Westman et al. , 2009).

Иерархическая кластеризация метаболитов и фагов на основе кратных изменений метаболитов относительно неинфицированного состояния подтверждает отсутствие «универсального» ответа хозяина (рис. 3). Для каждого фага ответы в моменты времени образуют тесно связанную ветвь кластера, а группы метаболитов, которые приписывают разделение ветвей, показаны вверху рисунка и будут обсуждаться в последующих параграфах.

Иерархическая кластеризация, основанная на корреляциях между векторами кратных изменений среднего метаболита, выявляет фаг-специфические изменения в метаболизме хозяина.Цветная полоса показывает кратное изменение различных метаболитов (столбцы) для разных образцов (строки). Слева находится иерархическое дерево, показывающее взаимосвязь между различными образцами. Справа указаны различные временные точки и инфицирующий фаг для каждого ряда кратных изменений метаболитов. Вверху показаны соответствующие пути для кластеров метаболитов. АК, аминокислоты; nucl, нуклеотид; брюки, пантотенат; PPP, пентозофосфатный путь.

Сравнительный анализ путей между фагами показывает центральную роль метаболизма пиримидина и накопления нуклеотидных / аминосахаров. метаболиты.Все существенно затронутые пути суммированы на дополнительном рисунке S2. Помимо постепенного изменения с течением времени путей, участвующих в метаболизме нуклеотидов и аминокислот (например, PEV2), для различных фагов были обнаружены лишь ограниченные временные вариации. Чтобы облегчить визуальное сравнение между фагами, анализы обогащения в разные моменты времени были объединены (рис. 4).

Обогащение метаболических путей для различных фагов. Результаты анализа обогащения показаны для всех шести фагов (столбцы) и для всех значительно уменьшенных и увеличенных путей (строки).Цветовая шкала показывает отсечку для значений P . Обратите внимание, что пути показаны только в том случае, если хотя бы одна временная точка показывает обогащение P -значение <0,05.

Большинство обогащенных путей могут быть связаны с определенными требованиями во время репликации фага. Во-первых, наиболее негативно затронутые пути связаны с метаболизмом аминокислот, со снижением метаболизма 14/20, 11/20, 10/20, 4/20 и 3/20 аминокислот (и предшественников) во время инфицирования YuA, 14-1, PEV2, LUZ19 и LUZ24 соответственно (рисунок 4).Это снижение можно объяснить либо уменьшением продукции, либо повышенным включением этих аминокислот в белки, не компенсируемым увеличением продукции. Повышенное потребление аминокислот при образовании фаговых частиц кажется наиболее логичной гипотезой. Однако не все фаги истощают аминокислоты в равной степени, тогда как гигантский фаг phiKZ даже не демонстрирует этого снижения. Это наблюдение указывает на разные уровни зависимости от ресурсов клетки-хозяина, как обсуждается ниже.

Во-вторых, были затронуты множественные пути, участвующие в метаболизме нуклеотидов. Пиримидиновый путь, который производит необходимые пиримидиновые нуклеотиды для репликации ДНК, обогащен повышенными метаболитами для всех проанализированных фагов, за исключением 14-1 (рис. 4). Используя диаграмму Венна, было визуализировано перекрытие измененных метаболитов между фагами (дополнительный рисунок S3). Большинство конечных пиримидиновых нуклеотидов увеличиваются при всех инфекциях, тогда как промежуточные соединения увеличиваются только для phiKZ и даже уменьшаются для PEV2, LUZ24 и YuA (дополнительный рисунок S3).Интересно, что метаболизм пуринов был обогащен только повышенными метаболитами во время инфекции YuA. Это намекает на разницу в потребности / потреблении пиримидина и пуриновых нуклеотидов во время фаговой инфекции. Уровни метаболизма глутатиона снижаются как LUZ19, так и YuA (дополнительный рисунок S2). Глутатион необходим для защиты от окислительного стресса и повышения активности рибонуклеотидредуктаз в метаболизме нуклеотидов (Masip et al., 2006). Эти ферменты катализируют образование дезоксирибонуклеотидов из рибонуклеотидов, что является важным этапом репликации фаговой ДНК.

Метаболиты пантотената и метаболизм кофермента А (КоА) снижены во всех фагах, кроме phiKZ (рис. 4). КоА играет важную роль во многих путях передачи клеток-хозяев жизненно важных компонентов и энергии (Леонарди и др., 2005). Обогащение пути пантотената и КоА среди пониженных метаболитов замедлит метаболизм хозяина. Это может быть объяснено фагом-индуцированным захватом или остановкой метаболизма хозяина. Однако, хотя уровни метаболитов пантоата и аспартата действительно снижены, некоторые промежуточные метаболиты и уровни CoA даже повышаются некоторыми фагами, например, PEV2, LUZ24 и YuA (дополнительный рисунок S4).В этих случаях наблюдаемое снижение метаболизма КоА также может быть вызвано повышенным потреблением КоА.

Третий путь, затрагиваемый всеми фагами, кроме YuA, – это метаболизм аминосахаров и нуклеотидных сахаров (дополнительный рисунок S5). Нуклеотидные сахара являются строительными блоками для пептидогликана и липополисахаридов, необходимых для роста и деления клеток. Существует множество примеров фаговых белков, которые ингибируют клеточное деление или биосинтез клеточной стенки, таких как лизисный белок E phiX174 (Bernhardt et al. , 2001) или kil-белков в фагах Mu (Wagoner et al., 1989), P22 (Semerjian et al., 1989), lambda (Sergueev et al., 2001) и Sf6 (Casjens et al., 2004). Гомологи этих белков обладают только низкими уровнями сходства последовательностей (Sau et al., 2008) и еще не были идентифицированы в этих фагах Pseudomonas . Однако повышенные уровни нуклеотидных сахаров, по-видимому, указывают на присутствие фаговых белков, ингибирующих клеточное деление или биосинтез клеточной стенки. Это дополнительно иллюстрируется увеличением биосинтеза пептидогликана и липополисахарида во время инфекции PEV2, LUZ24 и phiKZ.Фактически, членов Phikzlikevirus кодируют тубулиноподобный белок (Kraemer et al., 2012), который позиционирует фаговую ДНК в центре клетки и вызывает остановку деления клетки-хозяина во время инфекции (Ceyssens et al., 2014 ). Другие ранние белки, ингибирующие клеточное деление, также были идентифицированы в LUZ7, N4likevirus like PEV2 (Wagemans et al., 2014).

Большинство оставшихся путей, обогащенных повышенными метаболитами, участвуют в углеводном обмене хозяина, который производит необходимые строительные блоки для производства биомассы, однако затронутые источники углерода различаются между фагами (рис. 4).Интересно, что ни один из центральных путей метаболизма углерода (например, цикл TCA, гликолиз) не был обогащен. В заключение, этот анализ обогащения путей выявляет в первую очередь фаг-специфическое влияние на физиологию хозяина, центральную потребность в пиримидиновых нуклеотидах и повсеместное накопление нуклеотидных сахаров во время фаговой инфекции.

Стрессовые метаболиты хозяина обнаруживают фагоспецифическое влияние на различные стрессовые реакции

В ответ на различные стрессы, P. aeruginosa продуцирует вторичные молекулы-мессенджеры, которые обеспечивают межклеточную коммуникацию и скоординированные ответы (Jimenez et al., 2012). Чтобы оценить, может ли фаговая инфекция вызывать эти стрессовые реакции хозяина, были проанализированы обнаруженные метаболиты. Хотя многие из них не были обнаружены (например, AHL, c-di-GMP и cAMP), можно было проанализировать как сигнал ppGpp, так и сигнал хинолона Pseudomonas (PQS).

Во-первых, ppGpp контролирует скорость роста бактерий, ингибируя продукцию рибосомной РНК (Potrykus and Cashel, 2008; Potrykus et al. , 2011). Он также точно регулирует метаболизм путем регуляции транскрипции ферментов, участвующих в метаболизме аминокислот, и связывания ферментов, участвующих в метаболизме нуклеотидов (Gallant et al., 1971; Хохштадт-Озер и Кашел, 1972; Потрикус, Кашел, 2008). Высокие уровни этой молекулы связаны со строгой реакцией, которая возникает при воздействии аминокислотного голодания или теплового шока (Traxler et al., 2008; Hauryliuk et al., 2015). Уровень этой молекулы увеличивается во время инфицирования LUZ19, 14-1 и YuA, тогда как он остается стабильным для phiKZ и даже снижается для LUZ24 и PEV2 (http://www.biw.kuleuven.be/LoGTdb/phageBiosystems/Pathways.aspx? cpd = C01228). Это четкое различие между фагами, по-видимому, не коррелирует с другими наблюдаемыми метаболическими различиями, такими как пониженные уровни аминокислот во многих фагах (YuA, 14-1, PEV2, LUZ19 и LUZ24).Это, по-видимому, указывает на активное вмешательство в строгий ответ во время фаговой инфекции.

Второй метаболит стресса, «PQS», запускает автолиз и фрагментацию ДНК, одновременно снижая метаболическую активность неповрежденных бактерий и повышая защиту от окислительного стресса (D’Argenio et al. , 2002). Он играет центральную избирательную роль в выживании наиболее приспособленных (Häussler and Becker, 2008). Уровень метаболита PQS увеличивается при инфицировании YuA, 14-1 и LUZ24 (http: // www.biw.kuleuven.be/LoGTdb/phageBiosystems/Pathways.aspx?cpd=C11848), что указывает на реакцию хозяина, направленную на защиту наиболее приспособленных (неинфицированных) клеток путем замедления метаболизма и уничтожения восприимчивых (инфицированных) клеток. Удивительно, но уровни PQS не повышаются при инфицировании phiKZ, LUZ19 и PEV2. Либо активация системы PQS не является общим ответом хозяина, либо эти фаги развили неизвестные механизмы, чтобы блокировать синтез PQS.

Наблюдаемые корреляции между фаг-специфическими метаболическими ответами и прогнозируемыми AMG

Для исследования того, что вызывает фаг-специфическое влияние на физиологию хозяина, все фаговые геномы были проверены на потенциальные AMG с использованием инструмента биоинформатики BLASTn (Таблица 2) (Altschul et al. al., 1990). Количество идентифицированных потенциальных AMG было ограничено во всех фагах (около 3% всех генов), и большинство из них были AMG класса I, которые, как предполагается, участвуют в метаболизме нуклеотидов. Их присутствие, вероятно, объясняет общее влияние на метаболизм пиримидина у большинства фагов, соответствующее центральной потребности в нуклеотидах в репликации вирусного генома. Фактически, повышенные уровни метаболитов в этом пути, а также метаболизм аминосахаров и нуклеотидных сахаров также были выдвинуты гипотезой на основе метагеномного скрининга обогащенных вирусных вспомогательных генов из Глобального обзора океана (Enav et al., 2014). Авторы предположили, что вирусы несут эти метаболические гены для увеличения пула нуклеотидов двумя способами: путем рециклирования нуклеотидов клеточного генома и транскриптома (Powell et al., 1992; Ueno and Yonesaki, 2004; Lavigne et al., 2013) и / или направляя метаболизм хозяина для обеспечения субстратов для синтеза de novo (Thompson et al. , 2011).

Действительно, гигантский миовирус phiKZ перенаправляет метаболизм хозяина на обеспечение субстратов для синтеза de novo (рис. 5).Геном этого гигантского вируса содержит семь AMG, которые могут быть связаны с пиримидиновым путем (таблица 2). Непосредственно после заражения промежуточные соединения синтеза пиримидина de novo демонстрируют явное увеличение (например, N -карбамоил-1-аспартат, (S) -дигидрооротат) с последующим медленным увеличением монофосфатов нуклеотидов (рис. ). Учитывая кодирующий потенциал этого гигантского вируса (280,3 т.п.н.) и его независимую от хозяина схему регуляции транскрипции (Ceyssens et al., 2014), возникает соблазн рационализировать аналогичную независимость доступных ресурсов хозяина на уровне метаболома. Действительно, phiKZ, по-видимому, не влияет на метаболиты клетки на ранней стадии заражения, но примерно 10% всех аннотированных метаболитов постепенно накапливаются на поздних стадиях инфицирования (рис. 2а).

Как стратегия рециклинга, так и de novo синтез пиримидиновых нуклеотидов присутствуют в наборе фагов. Графики показывают кратные изменения метаболитов пиримидинового пути на разных стадиях инфекции (черный-контроль, оранжевый-YuA и синий-phiKZ).YuA перерабатывает нуклеотиды (оранжевый оттенок), характеризуется быстрым увеличением количества нуклеотидов. PhiKZ показал повышенный синтез de novo (синий оттенок), характеризующийся увеличением ранних строительных блоков. Ось y показывает кратное изменение, ось x показывает моменты времени во время заражения (в минутах), аннотированное название метаболита и масса иона показаны над графиком. Цветные квадраты указывают на ферментативные реакции, кодируемые YuA (оранжевый) и phiKZ (синий). Также выделены метаболиты, упомянутые в тексте.

Поскольку другие фаги содержат геномы меньшего размера, им может не хватать кодирующей способности для создания функционирующего метаболизма хозяина, и они больше полагаются на истощение ресурсов хозяина. Этим можно объяснить немедленное увеличение нуклеотидных монофосфатов (например, dTMP и dCMP) в метаболизме пиримидина во время инфицирования сифовирусом YuA. Скорее всего, это результат деградации генома хозяина из-за неизменных уровней вышеупомянутых промежуточных продуктов (Рисунок 5) и присутствия предсказанной экзонуклеазы (gp6) в геноме YuA (Таблица 2).По сравнению с phiKZ, более мелкий фаг YuA (58,6 т.п.н.) использует стратегию «пиявки», нацеленную на сбор метаболитов у хозяина. Фактически, после заражения наблюдается немедленный отрицательный эффект примерно на 17% всех измеренных метаболитов, что приводит к отчетливому метаболическому эффекту для этого фага (Рисунок 3) и большому количеству негативно затронутых путей (Рисунок 4). Однако немедленная деградация генома хозяина также может объяснить общий отрицательный эффект, наблюдаемый при YuA. Это наглядный пример того, как присутствие одного AMG, в данном случае нуклеазы, приводит к совершенно разному метаболическому воздействию.

Второй пример роли AMG был обнаружен при сравнении воздействия LUZ19 и LUZ24. На первый взгляд, эти два фага показывают очень похожие проценты увеличения и уменьшения метаболитов во время инфекции (рис. 2а), что может быть объяснено их относительной близостью в пределах популяционной сети (рис. 1). Оба фага вызывают повышение уровня нуклеотидов после первой трети заражения (дополнительный рисунок S6). Поскольку оба они кодируют эндонуклеазу gp23 для LUZ19 и gp35 для LUZ24 (таблица 2), наблюдаемое увеличение, вероятно, вызвано деградацией генома хозяина, что уже было экспериментально показано для LUZ19 (но не LUZ24) в начале репликации вирусного генома. (после первой трети заражения) (Lavigne et al., 2013). Однако иерархическая кластеризация выявила больше различий на уровне метаболитов между LUZ24 и LUZ19 (Рисунок 3). Сравнение кодированного содержания AMG выявило три AMG, которые присутствуют в LUZ24, но отсутствуют в LUZ19 (Таблица 2).

LUZ24 gp19 представляет собой предсказанную l-глутамин-D-фруктозо-6-фосфатамидотрансферазу (также называемую глюкозамин-6-фосфатсинтазой, glmS ). Этот белок катализирует лимитирующую скорость ферментативную стадию биосинтеза de novo UDP-GlcNAc, активированной формы N -ацетилглюкозамина (Milewski, 2002).Этот метаболит необходим для биосинтеза пептидогликана и липополисахарида (Mirelman and Nuchamowitz, 1979; King et al., 2009). В конце инфицирования LUZ24 уровень UDP-GlcNAc (C00043) действительно значительно повышается (FC _{35 минут} = 1), чего не наблюдается для LUZ19. Это указывает на то, что LUZ24 gp19 действительно представляет собой новую функциональную глюкозамин-6-фосфатсинтазу. Присутствие этого AMG привело к более низкому обогащению метаболизма аминосахара за счет увеличения метаболитов в LUZ24 по сравнению с LUZ19 (дополнительный рисунок S2).Скорее всего, это результат пониженного накопления предшественников перед этой ферментативной стадией, ограничивающей скорость. Хотя для этого фага не удалось получить стабильных лизогенных изолятов (Ceyssens et al., 2008), он генетически гомологичен (идентичность последовательности 71%) умеренному фагу PaP3 (Tan et al. , 2007). Этот AMG может быть артефактом своей прежней умеренной природы, где он принесет пользу хозяину во время лизогении (Feiner et al., 2015). Два других AMG, присутствующие исключительно в LUZ24, участвуют в метаболизме глутатиона (таблица 2).Метаболиты этого пути уменьшаются только во время инфекции LUZ19, тогда как они остаются стабильными во время инфекции LUZ24. Это снижение, вероятно, вызвано окислительным стрессом из-за продукции фагового потомства, AMG в LUZ24 могут компенсировать это падение и, таким образом, уменьшить окислительный стресс (Рисунок 4).

Фаг 14-1 кодирует два предсказанных AMG, один из которых участвует в метаболизме пиримидина и является гомологом полинуклеотидкиназы Т4 (PnkP) (таблица 2). Во время заражения 14-1 экспонаты оба увеличились (7.2%) и снижение (7,7%) метаболитов (рис. 2а). Несмотря на присутствие этого AMG, это единственный фаг, у которого пиримидиновый путь не обогащен повышенными метаболитами (рис. 4). В T4 PnkP восстанавливает индуцированное хозяином расщепление тРНК хозяина (например, лизина) риботоксинами, чтобы обойти попытку хозяина заблокировать синтез белка T4 (Amitsur et al. , 1987; Wang et al., 2015). Метаболиты, связанные с метаболизмом аминокислот, снижаются на ранних этапах короткой инфекции 14-1 (<15 мин), тогда как к концу инфекции этот отрицательный эффект менее выражен (дополнительный рисунок S2).Эти наблюдения показывают, что присутствие гомолога PnkP может позволить 14-1 реагировать на сработавшую защиту хозяина и завершить свой быстрый цикл инфицирования.

Последний фаг, PEV2, принадлежит к тому же роду ( N4likevirus ), что и розеофаг Φ2047B, исследованный Ankrah et al. (2014). Поскольку оба фага имеют общую организацию генома, ожидалось сходство в ответе хозяина. Действительно, после одного цикла заражения наблюдается увеличение примерно 20% обнаруженных метаболитов, тогда как только небольшая часть (4.8%) значительно снизилась (рис. 2а). Однако на ранней стадии заражения было снижено до 10% измеренных метаболитов, чего не наблюдалось для розеофага (рис. 2а). Это происходит из-за снижения количества метаболитов, связанных с аминокислотами, на ранней стадии инфекции, которое со временем восстанавливается. PEV2 кодирует только два предсказанных AMG, которые не могут объяснить наблюдаемые эффекты на метаболизм аминокислот (дополнительный рисунок S2).

Хотя идентифицированные и описанные AMG уже предлагают некоторые объяснения фагоспецифичных метаболических эффектов, многие другие эффекты не могут быть приписаны прогнозируемым AMG в настоящее время.Учитывая большое количество кодируемых вирусных генов, которые не имеют какого-либо функционального предсказания во всех этих фагах, мы можем предположить значительную важность неизвестных, «неферментативных» пептидов в метаболизме. Такие AMG технически можно определить как AMG класса II, хотя у них отсутствует какая-либо прямая метаболическая функция. Идентифицируется все больше и больше таких пептидов, например, взаимодействие раннего белка LUZ7 (gp30) с белком, участвующим в метаболизме полиаминов (PA4114) (Wagemans et al., 2014) или ранний белок phiKMV (gp9), который, как предполагается, влияет на цикл TCA (Roucourt et al., 2009). Эти результаты подчеркивают необходимость дополнительных усилий для характеристики функции таких небольших, неизвестных вирусных генных продуктов.

База данных с открытым доступом обеспечивает прямую интерпретацию и интерактивный анализ данных метаболомики.

К сожалению, наборы данных метаболомики систем фаг – хозяин скудны и труднодоступны, несмотря на тот факт, что все сообщество могло бы извлечь выгоду из таких больших наборов данных.По этой причине была создана интерактивная база данных, обеспечивающая открытый доступ к данным и простой в использовании визуальный интерфейс для их анализа и сравнения (http://www.biw.kuleuven.be/LoGTdb/phageBiosystems/Home.aspx) . Интерпретация данных возможна на разных уровнях: сравнительный анализ фагов, фаг-специфическая интерпретация и визуализация пути / метаболита. Эти инструменты должны позволить исследователям изучить конкретные метаболиты / ответы на фаговую инфекцию. Наконец, эта база данных является первым шагом к онлайн-платформе, способной интегрировать наборы данных протеомики, метаболомики и транскриптомики, что благодаря технологическим достижениям в этих областях позволяет изучать фаговую инфекцию на системном уровне.