Снэтчин шредингера гагина где взять: Mystery Manor – Загадочный дом на iPad

Содержание

Коллекции. № 1-141 – Коллекции – Полезное – Каталог статей

Название коллекции Предметы коллекции Награда Итоговый подарок
1. Фильм, фильм, фильм!

Готовый сценарий

Кресло режиссера

Кинокамера

Снимки с кинопроб

Бюджетные деньги

Юпитер х3,

Кольца Марса и Венеры х3,

Импактный дробитель

Кнопка продюсера
2. Вечер премьеры

VIP-билеты

Напитки для фуршета

Мужской смокинг

Вечернее платье

Красная дорожка

Магический молот х3,

Серебряные отмычки х20,

Оккультный посох х12

Яркая афиша
3. Вокруг света

“Золотой медведь”

“Золотой лев”

“Золотой Георгий”

“Золотая раковина”

“Хрустальный глобус”

Золотая бомба х5,

Ключ Лицея х15,

Око бури х2

“Золотая пальмовая ветвь”
4. Заслуженная награда

“Золотой глобус”

“Сезар”

“BAFTA”

“Ника”

“Гойя”

Английский завтрак,

Жезл Гермеса х30,

1000 опыта

“Оскар”
5. Кумиры и учителя

Ситечко Жоржа Мельеса

Сигара Альфреда Хичкока

Эскиз логотипа “Диснея”

Часы Федерико Феллини

Камера Стивена Спилберга

Кубок скелета х20,

Воздуходув Гагина х3,

Масленка х20

Пленка Сергея Эйзенштейна
6. Волшебный фонарь

Кинетоскоп Эдиссона

Аппарат братьев Люмьер

Раритетный фильмоскоп

Кинопроектор “Классик”

Цифровой проектор

Сэндвич,

Генератор Фарадея х5,

Ключ Директора х15

Домашний Кинотеатр
7. Столовая платина

Платиновая вилка

Платиновый нож

Платиновая ложка

Платиновые щипцы для омаров

Платиновые палочки для суши

500 монет,

компас

Столовый набор
8. Золотая горничная

Платье

Фартук

Туфельки

Чепец

Метелочка для пыли

700 монет Золотая горничная
9. Необычные продукты

Яйца феникса

Птичье молоко

Мука из мандрагоры

Золотое яблоко

Вырезка тиранозавра

800 монет,

компас

Удивительно блюдо
10. Порванное колье

Золотая цепочка

Золотой кулон с агатом

Бриллиантовые подвески

Изумрудные подвески

Рубиновые подвески

1000 монет Золотое колье
11. Напитки мира

Виски “Пьяный Джо”

Портвейн “Морской бриз”

Коньяк “Дофин”

Вино “Искушение”

Водка “Русалочка”

800 монет,

заморозка

Коктейль “Слеза Венедикта”
12. Загадочные рецепты

Суши из Кракена

Фрикасе из диплодока

Феникс на гриле

Рулька из Чупакабры

Василиск в яблоках

Катушка Теслы Тайная поваренная книга
13. Ловцы снов

Ловец снов чероки

Ловец снов гуронов

Ловец снов дакота

Ловец снов могикан

Ловец снов делавер

800 монет,

лампа иллюминатов

Вождь ловцов

14. Императорские

десерты 

Торт “Наполеон”

Шоколадный мусс “Обама”

Фруктовый салат “Цезарь”

Ромовая баба “Виктория”

Сладкий ролл “Микадо”

Чашка кофе Торт “Империя”
15. Редкие марки

Королева Виктория

Александ Македонский

Леонардо да Винчи

Эрнест Хэмингуэй

Мерилин Монро

1000 монет,

150 опыта

Редкая коллекция марок
16. Инструменты сантехника

Разводной ключ

Вантуз

Набор резцов

Клещи

Ножовка

1200 монет,

будильник

Золотая ванна
17. Королевское чаепитие

Фарфоровая чашка

Фарфоровое блюдце

Фарфоровый чайник

Фарфоровый молочник

Фарфоровая сахарница

1400 монет,

гневное изваяние

Королевский чай
18. Страх темноты

Монстр из шкафа

Существо под кроватью

Домовой

Полтргейст

Зубная фея

1600 монет,

мощный фонарь

Страх темноты
19. Таинственные трофеи

Щупальце Кракена

Клык саблезубого тигра

Крыло птеродактиля

Бивень мамонта

Череп тиранозавра

1800 монет,

световая шашка

Голова трицератопса
20. Ванная русалки

Пена “Афродита”

Соль “Саргассы”

Шампунь “Летучий голландец”

Мочалка “Атлантида”

Крем “Бермудский треугольник”

2000 монет,

100 опыта

Ванная русалки
21. Пыльные кролики

Кролик Джек

Кролик Том

Крольчиха Тамми

Кролик Бэзил

Крольчиха Джейн

Магнит
Золотая метла
22. Мужской костюм

Брюки

Пиджак

Рубашка

Галстук

Туфли

Гневное изваяние,

лампа иллюминатов

Пальто
23. Декоративные собачки

Мопс

Шпиц

Чихуахуа

Китайская хохлатая

Йоркширский терьер

Медный феникс Чау-чау
24. Мисс элегантность

Вечернее платье

Коктейльное платье

Этническое платье

Бальное платье

Летнее платье

2200 монет,

150 опыта

Платье невесты
25. Всегда на каблуках

Сапожки

Угги

Вечерние туфли

Босоножки

Тропические сандалии

Катушка Теслы х5,

Гневное изваяние х5,

Лампа иллюминатов х5

Туфли ручной работы
26. Цыганская сбруя

Цыганская уздечка

Цыганская попона

Сапоги цыгана

Звонкая гитара

Цыганские стремена

Цыганский кнут

1000 монет,

Рунные камни х70

Золотое седло
27. Гордость цыгана

Красная рубаха

Золотая цепь

Сапоги цыгана

Звонкая гитара

Нож цыгана

3000 монет,

Рунные камни х25

Цыганская кибитка
28. Кони привередливые

Конь вороной

Конь белый

Конь буланый

Конь серый

Конь ретивый

3500 монет,

Серебряная подкова х50

Цыганские скакуны
29. Цыганская красота

Бусы цыганки

Юбка цыганки

Шаль цыганки

Сапожки цыганки

Кофта цыганки

8000 монет,

Рунные камни х80

Танцующая цыганка
30. Охотники мира

Бушмен с бумерангом

Охотник на слонов

Индеец-гурон

Алеут-китобой

Охотник-пигмей

Слон мудрости х5,

Медный Феникс

Золотой охотник
31. Охотничьи собаки

Курцхаар

Бассет

Сеттер

Поинтер

Гончая

6000 монет,

Английский завтрак

Милый щенок
32. Удивительное оружие

Арбалет Гатлинга

Ружье Тесла

Капкан да Винчи

Манок Бетховена

Ловушка Шредингера

Медный Феникс,

5000 монет

Робот-охотник
33. Пушистые котики

Ангорская кошечка

Шотландский вислоухий

Персидский кот

Британская мраморная

Мейнкун

Шоколад,

Медный Клевер х4

Вольдемор
34. Видения будущего

Карты Таро

Книга перемен

Руны Футарк

Свеча

Пирожки с предсказаниями

Медный Клевер х5,

Медная Подкова х100

Золотая Фортуна
35. Спиритический сеанс

Спиритическая доска

Столик для гаданий

Курительница фимиама

Волшебное зеркало

Зачарованный амулет

1500 монет,

Английский завтрак х2

Женщина в белом
36. Гороскопы

Восточный гороскоп

Гороскоп ацтеков

Гороскоп друидов

Рунный гороскоп

Зодиак

15000 монет Книга Судьбы
37. Магические книги

Книга Белой Магии

Книга Черной Магии

Книга Некромантии

Книга Чудовищ

Книга Восточной Магии

600 опыта,

6000 монет

Книга Мерлина
38. Ведьмино искусство

Шляпа ведьмы

Волшебная палочка

Метла ведьмы

Платье ведьмы

Летучая обезьянка

Гневное изваяние  х8,

Лампа иллюминатов х8,

Катушка Теслы х8

Ведьмочка на метле
39. Великий Чародей

Шляпа Чародея

Трубка

Посох Чародея

Ручной дракончик

Пылающий меч

Гневное изваяние х10,

Лампа иллюминатов х10,

Катушка Теслы х10

Великий Маг
40. Курительный набор

Сигара

Трубка

Кальян

Трубка индейцев

Пачка сигарет

5000 монет,

Бронзовый Феникс

Ментоловые конфеты
41. Словари

Коптский словарь

Арамейский словарь

Латинский словарь

Словарь санскрита

Шумерский словарь

3 Золотых Феникса,

12000 монет

Коллекция словарей
42. Слава героев

Герб Роланда

Герб Карла Великого

Герб Зигфрида

Герб Ричарда

Герб Ланселота

Лампа иллюминатов,

Сэндвич,

8200 монет

Герб героя легенд
43. Замки

Простой замок

Хитрый замок

Сложный замок

Замок с секретом

Прочный замок

Слон мудрости х3,

чашка кофе,

5400 монет

Сверхнадежный замок
44. Гербовые животные

Лев

Орел

Медведь

Грифон

Золотой единорог

Гневное изваяние,

сэндвич,

6800 монет

Дракон
45. Чемоданы и саквояжи

Чемодан

Саквояж

Круглый чемодан

Большой чемодан

Чемодан на колесиках

Медный Феникс,

шоколад,

6000 монет

Гардероб
46. Доспехи героя

Доспех

Шлем

Меч

Щит

Плащ

Золотой слон,

английский завтрак,

9000 монет

Золотой рыцарь
47. Искусство икебаны

Икебана влюбленных

Икебана из мандрагоры

Икебана богатства

Икебана из ирисов

Икебана самурая

Медный Хотей,

3000 монет

Золотая икебана
48. Мудрость нэцке

Собачка Фу

Мудрец Хотей

Ямабуси

Дайкоку

Три обезьяны

Слон Мудрости,

4000 монет

Золотой дракон
49. Путь воина

Шлем самурая

Нагрудник самурая

Сандалии самурая

Кимоно самурая

Катана

Медный Феникс,

4500 монет

Статуэтка самурая
50. Возлюбленная самурая

Сандалии-гэта

Кимоно гейши

Широкий пояс

Веер

Обимакура

Медный клевер,

3500 монет

Статуэтка гейши
51. Бонсаи

Бонсай-сосна

Бонсай-сакура

Бонсай-дуб

Бонсай-момидзи

Бонсай-фикус

Лампа иллюминатов,

5000 монет

Древо удачи
52. Вечные двигатели

Водяной двигатель

Двигатель Ньютона

Гиро-двигатель

Кинетический двигатель

Двигатель Эйнштейна

Медный Феникса х2,

5000 монет

Вечная мельница
53. Летательные аппараты

Дирижабль

Орнитоптер

Винтокрыл

Геликоптер

Дисколет

Лампа иллюминатов х2,

Золотой Слон,

4500 монет

Аэроспидер
54. Автомобили будущего

Водородный автомобиль

Реактивный автомобиль

Трехколесный автомобиль

Автомобиль на биотопливе

Гибридный болид

Инь-Ян х2,

20 батареек,

6400 монет

Ракетомобиль
55. Сбор доказательств

УФ Лампа

Пинцет

Перчатки

Измеритель

Лупа

Медных Подкова х35,

Рунные камни х35,

4000 монет

Чемодан криминалиста
56. Личные вещи Агента

Фетровая шляпа

Тренч

Жетон агента

Диктофон

Револьвер

Батарейка х35,

магнит,

4500 монет

Черные очки
57. Они среди нас

Тунгусский монолит

Розуэльский череп

Барельеф

Индейский тотем

Хрустальная пирамида

Гравицапа х25,

Световая шашка х5,

8000 монет

Золотой шар
58. Секретные приспособления

Детектор паронормальной активности

Стиратель памяти

Универсальный переводчик

Часы с компьютером

Спецрация

Секретный контейнер х20,

Бомба х5,

10000 монет

Летающий корабль
59. Механические помощники

Робот-плотник

Робот-электрик

Робот-маляр

Робот-каменьщик

Робот-погрузчик

Коктейль,

Бомба х5,

Гравицапа х20

Железный прораб
60. Пишущие машинки

“Ламберт”

“Ундервуд”

“Хаммонд”

“Олимпикс”

“IBM”

Золотой клевер,

Катушка Теслы х2,

1000 монет

Волшебный “Ремингтон”
61. Великие писатели

Шекспир

Пушкин

Достоевский

Хэмингуэй

Агата Кристи

Золотой слон,

Гневное изваяние,

2000 монет

Лев Толстой
62. Снэтчины-актеры

Конан-варвар

Гамлет

Шерлок Холмс

Д’Артаньян

Онегин

Золотой Феникс,

Лампа иллюминатов,

3200 монет

Гарри Поттер
63. Лики Африки

Маска льва

Маска воина

Маска Леопарда

Маска охотника

Маска вождя племени

8000 монет,

Золотой слон х3,

Шашка х5

Маска шамана Мбонго
64. Ритмы Черного континента

Там-там охотника

Боевой Там-там

Праздничный там-там

Ритуальный там-там

Там-там вождя

9000 монет,

Рунные камни х25,

Бомба х3

Там-там шамана
65. Герой сафари

Ассегай

Щит массаи

Зулусский лук

Нгбака

Духовая трубка

7500 монет,

Магнит х2,

Золотой клевер х2

Афроснэтчин-охотник
66. Сердце Африки

Пробковый шлем

Компас путешественника

Карта Африки

Глиняная фляга

Багги

3000 опыта,

Английский завтрак х5,

Золотой Феникс х2

Алмаз “Сердце Африки”
67. Искусство оригами

Журавлик

Лиса

Бабочка

Кролик

Лягушка

Серебряный Хотей,

Шашка х2,

1000 опыта,

4200 монет

Дракон
68. Японские блюда

Суп Мисо

Роллы

Суши

Васаби

Имбирь

Серебряное солнце,

Лампа иллюминатов х2,

5100 монет

Блюдо из рыбы фугу
69. Лицедеи Кабуки

Маски монаха

Маска актера

Маска призрака

Маска духа-они

Маска императора

Золотой клевер,

Бомба х2,

6300 монет

Маска Дракона
70. Огни в додзе

Бумажный фонарь

Дзен-фонарь

Счастливый фонарь

Фонарь влюбленных

Буддистский фонарь

Серебряный Инь-Ян х2,

Катушка Теслы х2,

7100 монет

Императорский фонарь
71. Музыка Дзен

Гонг

Флейта

Барабан

Трещотка

Сямисэн

Черепаха удачи,

Магнит х2,

8200 монет

Колокол
72. Оружие ниндзя

Кусаригама

Лук ниндзя

Нунчаки

Нагината

Меч ниндзя

Серебряный Инь-Ян,

2300 монет

Ниндзя с мечом
73. Секреты ниндзя

Сюрикены

Шипы

Духовая трубка

Амигаса

Сюко

Серебряное солнце,

2700 монет

Ниндзя в шляпе
74. Роковая девушка

Боевая заколка

Боевой веер

Вакидзаси

Боевой зонт

Коготь

Серебряная жаба,

3300 монет

Скользящая в тумане
75. Трофеи ниндзя

Золотой шлем

Генеральский веер

Генеральская катана

Сасимоно

Золотой доспех

Черепаха везения,

Световая шашка х2,

4300 монет

Генерал
76. Клан Черного Лотоса

Дзе-огородник

Цветочница-тян

Дачник-кун

Садовник-гири

Агроном-сан

Золотой слон,

Бомба х5,

5000 монет

Снэтчин-сэнсей
77. Морские обитатели

Коралл

Актиния

Медуза

Рыба-клоун

Осьминог

Золотой коралл х100,

10000 монет

Раковина с жемчужиной
78. Подводный мир

Руины

Грот

Затонувшая лодка

Коралловый риф

Подводный замок

Заморозка х5,

12000 монет

Золотая рыбка
79. Семь футов под килем

Ладья

Каравелла

Клиппер

Колесный параход

Океанский лайнер

Английский завтрак х2,

15000 монет

Ледокол “Арктика”
80. Великие мореплаватели

Магеллан

Колумб

Крузенштерн

Беринг

Нансен

800 опыта,

24000 монет

Кусто
81. Тайна глубины

Водолазный колокол

Акваланг

Костюм водолаза

Батискаф

Подводный робот

Гиперболоид Гагина х5,

20000 монет

Батискаф “Мир”
82. Точный маршрут

Транспортир штурмана

Капитанский циркуль

Корабельный компас

Морской секстант

Астролябия картографа

Лампа иллюминатов,

шоколад,

8400 монет

Золотой глобус
83. Оружие пиратов

Пистоль

Абордажная сабля

Мушкетон

Абордажный топор

Бомбарда

10800 монет,

Золотой Феникс х2

Пиратская пушка
84. Морские гады

Морской черт

Сцилла

Харибда

Ермунганд

Левиафан

12000 монет,

Золотой Клевер х2,

Слон мудрости х2

Кракен
85. Сокровища пиратов

Золотая монета

Проклятый алмаз

Заморские специи

Зловещий медальон

Карта сокровищ

Золотой слон,

Английский Завтрак,

14400 монет

Пиратский корабль
86. Знаменитые пираты

Капитан Хук

Капитан Блад

Джон Сильвер

Тайгер Ли

Сомалийский пират

6000 монет,

Слон Мудрости,

Гневное Изваяние

Черная Борода
87. Таинственный остров

Белый медведь

Экран

Туман

Люк

Обломки самолета

11000 монет,

Бомба х4,

шоколад,

Волшебная раковина х25

Остров
88. Робинзонада

Зонт Робинзона

Шляпа Робинзона

Попугай

Плот Робинзона

Хижина

11500 монет,

Золотой Слон х2,

Волшебная раковина х40

Снэтчин Пятница
89. Наследие Атлантов

Шлем атлантов

Обломок статуи

Амфора атлантов

Колонна

Голова Горгоны

11500 монет,

Английский завтрак,

Гневное изваяние х4,

Волшебная раковина х65

Снэтчин-атлант
90. Спортивные снаряды

Копье

Молот

Диск

Ядро

Шест

Золотой Клевер х2,

Шоколад х2,

3000 монет

Эстафетная палочка
91. Гимнастические Этюды

Гимнастический мяч

Обруч

Конь

Булавы

Кольца

Рунные камни х40,

Гравицапа х40,

Черепаха удачи х2,

500 опыта

Ленты
92. Мастер бега

Шиповки

Майка с номером

Барьер

Беговая дорожка

Колодки

Золотая семечка х30,

Английский завтрак х2

Снэтчин-победитель
93. Пятиборье

Бег

Плаванье

Конкур

Стрельба

Фехтование

1000 опыта,

4000 монет

Пятиборье
94. Командный дух

Гандбол

Волейбол

Баскетбол

Бейсбол

Регби

Батарейка х30,

Секретный контейнер х30,

Феникс х2,

Золотой слон х2

Кубок чемпиона
95. Воспоминания о море

Сан-тропе

Ибица

Калифорния

Каймановы острова

Мальдивы

Золотой коралл х100,

Магнит х2,

20000 монет

Курортный чемодан
96. Пляжные развлечения

Волейбол

Бадминтон

Серфинг

Аквабайкинг

Дайвинг

Сэндвич х5,

Штанга х3,

10000 монет

Замок из песка
97. Шик на пляже

Парео

Пляжный зонт

Пляжная сумка

Крем от загара

Пляжные бусы

Серебряное солнце,

Черепаха удачи,

10000 монет

Девушка-аниматор
98. Атолл “Бикини”

Бикини

Модный купальник

Откровенный купальник

Купальник-пландж

Купалник-бандо

Клевер х4,

Катушка Теслы х4,

10000 монет

Девушка на пляже
99. Пасхальные яйца

Пурпурное яйцо

Синее яйцо

Зеленое яйцо

Желтое яйцо

Красное яйцо

Пасхальный кулич х10 Шоколадное яйцо
100. Комитет Пяти

Роджер Шерман

Бенджамин Франклин

Томас Джефферсон

Джон Адамс

Роберт Ливингстон

2000 опыта,

Черепаха х2,

Гневное изваяние х2

Ричард Генри Ли
101. Огни большого праздника

Первое поселение

День независимость

Америка! Америка!

Свобода

Красная стрела

1500 опыта,

Серебряное солнце х2

Салютное орудие
102. Праздничный маскарад

Снэтчин-зверобой

Снэтчин-поселенец

Снэтчин-солдат

Снэтчин-рейнджер

Снэтчин-индеец

3000 опыта,

Катушка Теслы х5,

Хотей х2

Снэтчин Бенджамин
103. Космические корабли

Спутник-1

Восток-1

Союз-Аполлон

Буран

Космо-лайнер Один

Серебряный Хотей,

5000 монет

Орбитальная станция
104. Человек в космосе

Шлем космонавта

Скафандр

Кислородные баллоны

Ботинки космонавта

Перчатки космонавта

Катушка Теслы х2,

Золотой клевер,

4500 монет

Космонавт
105. Грезы о космосе

Корабль Жюля Верна

Корабль Уэллса

Корабль Толстого

Корабль Стругацких

Корабль Снегова

Серебряный Хотей х2,

Батарейка х10,

4200 монет

Летающая тарелки
106. Орбитальные станции

Станция Циолковского

Станция “Мир”

МКС

Орбитальный телескоп “Хаббл”

Орбитальный зонд

Батарейка х50,

4000 монет

Орбитальный город
107. Страж Вселенной

Лазерный пистолет

Световой клинок

Ионный пистолет

Бластер

Плазменая винтовка

Батарейка х25,

10000 монет

Гиперболоид Гагина
108. Праздник цветов

Букет роз

Букет тюльпанов

Весенний букет

Букет полевых цветов

Букет изысканных цветов

Черепаха удачи,

15000 монет

Весенние цветы
109. Ароматы страсти

Аромат жасмина

Аромат “Золотое солнце”

Сладкая вишня

Духи “Принцесса”

Духи “Свидание”

Серебряное пылающее сердце,

6000 монет

Духи “Вечная любовь”
110. Принц на белом коне

Браслет

Кулон

Кольцо

Запонки

Зажим для галстука

Серебряное изумрудное сердце,

12000 монет

Перстень с сердцем
111. Сладкое искушение

Эклеры

Буше

Зефир “Нежность”

Торт “Валентинка”

Тирамису

Золотое могучее сердце,

8000 монет

Сердечные конфеты
112. Терпкий вкус любви

Мохито

Маргарита

Манхэттен

Свидание на пляже

Б-52

Серебряное могучее сердце,

6000 монет

Пунш влюбленных
113. Елочные игрушки

Колокольчик

Звезда

Шишка

Леденец

Шарик

900 опыта,

7800 монет,

Пунш,

Оливье

Верхушка для елки
114. Солдатики

Спартанец

Легионер

Рыцарь

Гвардеец

Морпех

810 опыта,

8000 монет,

Индейка

Генерал
115. Машинки

Маленькая красная машинка

Клевая синяя машинка

Симпатичная желтая машинка

Джип

Спортивная машинка

630 опыта,

8600 монет,

Индейка х4

Машинка с большими колесами
116. Плюшевые игрушки

Мишка

Собачка

Котенок

Бегемотик

Динозаврик

720 опыта,

7200 монет,

Жаба х2

Кролик
117. Злые украшения

Шар-череп

Колючая мишура

Верхушка-ракета

Щар-бомба

Игрушка-булава

540 опыта,

9000 монет,

Оливье х5

Имбирный снэтчин
118. Новогодняя упряжка

Олени в синей сбруе

Олени в зеленой сбруе

Олени в красной сбруе

Сани

Кучер

Феникса х2,

14000 монет,

Оливье х2

Упряжка
119. Снэтчины-проказники

Снэтчин-Повар

Снэтчин-Горничная

Снэтчин-Сантехник

Снэтчин-Гадалка

Снэтчин-Охотник

13600 монет,

Пунш х7,

Клевер х3

Снэтчин-Генерал
120. Злые игрушки

Злой солдатик

Злой робот

Злая собака

Плюшевая акула

Плюшевый зомби

10000 монет,

Слон х5,

Оливье х5

Черный властелин
121. Живые мертвецы

Повар-зомби

Ожившая горничная

Мертвый сантехник

Охотник-нежить

Секретарша с того света

Катушка Теслы,

Гневное изваяние,

100 опыта

Голова зомби
122. Ужасные маньяки

Маска каннибала

Ужас подростков

Кричащая смерть

Мачете маньяка

Кошмарная перчатка

Английский завтрак,

Рунные камни х30,

Батарейка х30

Стул для маньяка
123. Скелет в шкафу

Костяная рука

Костяная нога

Черепус вульгарис

Туловище

Кость, бедренная кость

Лампа иллюминатов,

Катушка Теслы

Скелет бледный
124. Ночной гость

Клыки упыря

Плащ кровососа

Гроб вампира

Летучая мышь

Очки ночного охотника

200 опыта,

Рунные камни х25

Маска вампира
125. Монстр из пробирки

Машина-оживитель

Виселица

Скальпель

Железное сердце

Рука-автомат

Шоколад,

Батарейка х20

Невеста гомункула
126. Исчадие преисподней

Бесовский трезубец

Ведьмин котел

Плащ Мефистофеля

Договор с чертом

Перо и чернила

300 опыта,

Золотой слон

Злобный бес
127. Волк-оборотень

Серый волк

Волчий глаз

След волка

Волчья шкура

Голова волка

Золотой Феникс,

Рунные камни х10,

Батарейка х10

Вервольф
128. Проклятый пират

Треуголка пирата

Мартышка-зомби

Стеклянный глаз

Деревянная нога

Рука с крюком

Английский завтрак,

Золотой клевер

Сундук мертвеца
129. Тварь из болота

Рыболовный крючок

Гарпун

Рыболовная сеть

Костюм рыбака

Камень утопленника

Гиперболоид Гагина х3,

Рунные камни х10,

Батарейка х15

Аквариум утопленника
130. Ужас Сонной Лощины

Пылающая тыква

Черный конь

Проклятый меч

Плащ с капюшоном

Ужасное дерево

Английский завтрак х2,

Черепаха удачи

Всадник без головы
131. Хранитель пирамид

Золотой скарабей

Серп-копеш

Тиара фараона

Ладья Амон-Ра

Золотая пирамида

Золотой Феникс х2,

1500 опыта,

15000 монет

Мудрый феникс
132. Коварство соблазнения

Плеть суккуба

Любовное зелье

Туфельки суккуба

Разбитое сердце

Мистическое зеркало

Черепаха удачи х2,

2000 опыта

Роковая красотка
133. Вечный скиталец

Цепь с шаром

Саван

Фиал с ядом

Зловещий кинжал

Призрачный портрет

Слон х2,

10000 монет,

1800 опыта

Корона призрака
134. Каменный ужас

Таинственный склеп

Корона подземелий

Свиток с рунами

Гербовый щит

Волшебный гобелен

Английский завтрак,

Батарейка х30,

Рунные камни х30

Горгулья
135. Поднимающие нежить

Посох Темного пламени

Череп колдуна

Вещий ворон

Часы Плутона

Перстень властелина

Инь-Ян х3,

Лампа иллюминатов х3

Коса времени
136.Ночной мститель

Инфра-пуля

Стилет мстителя

Серебряный капкан

Лепаж мстителя

Дисперсионный огнемет

Предмет против Феноменов х7,

350 опыта

Винтовка “Мститель”
137. Оружие Ван Хельсинга

Перстень охотника

Серебряный сюрикен

Дай-катана

Пулемет “Архангел”

Пронзатель Гатлинга

Феникс х5,

Черепаха х5,

200 опыта

Арбалет-“Скорпион”
138. Оружие дневальщика

Чесночное ожерелье

Нитрат серебра

Меч дампира

Кулеврина дневальщика

Аркебуза дневальщика

Слон х5,

Клевер х5,

100 опыта

UV-резак
139. Изгоняющий монстров

Упокоитель нежити

Ведущий Специалист-Костолом

Истребитель Носферату

Забойщик Гомункулов I разряда

Охотник на Вервольфов

Английский завтрак х3,

Черепаха х3,

Феникс х3,

3000 Опыта

Премия Ван Хельсинга II степени
140. Непревзойденный охотник

Мастер экзорцист

Гроза Морской Нежити

Специалист Осушитель

Почетный истребитель маньяков

Безупречный Тыкворез

Английский завтрак х5,

Черепаха х5,

Феникс х5,

4500 опыта

Премия Ван Хельсинга I степени
141. Сокрушитель Нечистых

Мастер мумификации

Поборник нравственности

Охотник за привидениями

Ловец горгулий

Один против нежити

Английский завтрак х7,

Черепаха х7,

Феникс х7,

6000 опыта

Алмазная премия Ван Хельсинга

Genshin Impact: как получить Кольцо Хакусин 4⭐️?

Подробное прохождение финального квеста в задании мира Инадзумы Очищение священной сакуры в Genshin Impact. Победа над заразными опухолями и миазмами в расселине под горой Ёго.

Когда все барьеры сняты, остается всего один шаг на пути к восстановлению Священной сакуры. Кадзари нуждается в помощи со стороны Путешественника и Паймон. Далее представлено подробное прохождение Очищение Ёго в Инадзуме в Геншин Импакт.

Цели:

  • Вернитесь к Кадзари.
  • Отправляйтесь к расселине у подножия горы Ёго и поговорите с Кадзари.
  • Прыгайте вниз.
  • Победите всех противников и босса «миазмы».
  • Поговорите с Кадзари.

Как начать Очищение Ёго в Инадзуме в Genshin Impact

Данный квест завершает серию задания мира «Очищение священной сакуры«. Его можно пройти после снятия пяти барьеров в разных районах острова Наруками. Для этого требуется выполнить предыдущие квесты:

Прохождение Очищение Ёго в Инадзуме в Genshin Impact

Отправляйтесь к Кадзари через колодец деревни Конда, когда все барьеры будут сняты. Она сообщит, что корни Священной сакуры должны быть очищены от миазмов. Необходимо спуститься в расселину под горой Ёго (с южной стороны от храма Наруками).

Поговорите с Кадзари и прыгайте вниз. Сражайтесь с миазмами и порождаемыми этой субстанцией самураями. Бой проходит в 3 этапа:

  • Огненный самурай;
  • Электро самурай;
  • Огненный и Электро самурай.

Между появлением противников будут спавниться фонари, как при снятии барьеров в предыдущих квестах. Нужно также ориентироваться на рисунок Электро символа, висящего в воздухе, чтобы рисовать его по фонарям, начиная с того, над которым светится один лепесток.

Игрока постоянно будет поражать Громовое бедствие. Пользуйтесь Ветвями громовой сакуры, чтобы защищаться Электрогранумами.

После разговора сакура начнет расцветать и избавляться от поражения.

Поднимите с земли упавшую маску Кадзари.

Завершение ритуала очищения Священной сакуры даст ачивку «Торжественная встреча». 

Полное прохождение мирового задания Очищение Священной Сакуры в Геншин Импакт

Награды

Пройденный квест очищение Ёго помимо ачивки позволит игроку получить:

  • 50 Камней истока;
  • 5 Опыта героя;
  • Чертеж «Маска воспоминаний» для создания катализатора «Кольцо Хакусин»;
  • 50000 Моры.

Видеопрохождение

Следите за другими гайдами и прохождениями по Genshin Impact. Также можно ознакомиться со всеми головоломками и загадками Инадзумы, чтобы собрать максимум ценностей и наград на островах Электро-региона.

Остальные квесты в задании мира Очищение священной сакуры в Genshin Impact:

Состояние: Сноттингемшир (Assassin’s Creed Valhalla)

Сноттингемшир содержит 17 локаций «Состояние» в Assassin’s Creed Valhalla. Это пошаговое руководство поможет найти их все. Вы все еще можете вернуться ко всем картам после истории, но рекомендуется собирать все, когда вы проходите регионы до нового уровня.

Состояние отмечается золотыми значками на карте мира автоматически при синхронизации точки обзора. Состояние включает следующие типы коллекционных предметов: Слитки, Снаряжение, Способности, Запасы. Обычно это сундуки со снаряжением и материалами для улучшения вашего персонажа.

Нахождение всех предметов типа «Состояние» требуется для получения трофея/достижения «Награда перфекционисту!».

Если у вас есть вопрос/замечание/исправление или вы просто хотите чем-то поделиться, то дайте нам знать в комментариях под статьей. Зарегистрируйтесь на сайте, чтобы писать от своего имени, прилагать скриншоты и многое другое.

Содержание:

Состояние #1: Слиток

Состояние #2: Способность – Ядовитая ловушка (Оружие дальнего боя)

Состояние #3: Слиток

Состояние #4: Слиток

Состояние #5: Слиток

Состояние #6: Слиток

Состояние #7: Слиток

Состояние #8: Слиток

Состояние #9: Снаряжение – Плащ наставника (Снаряжение Ворона)

Состояние #10: Слиток

Состояние #11: Способность – Пинок Тюра (Оружие ближнего боя)

Состояние #12: Слиток

Состояние #13: Снаряжение – Маска наставника (Снаряжение Ворона)

Состояние #14: Слиток

Состояние #15: Запасы

Состояние #16: Запасы

Состояние #17: Запасы


Состояние #1: Слиток
 ↑ 

Этот Слиток можно найти на севере региона, в городе Хемторп. В задней части города вы найдете колодец. Разрушьте крышку и спрыгните вниз, чтобы найти сундук внутри.

Состояние #2: Способность – Ядовитая ловушка (Оружие дальнего боя)
 ↑ 

Это Состояние можно найти на севере региона, прямо у локации Убежище в руднике Одина. Оказавшись на вершине холма, вы увидите большую пропасть. Прыгайте вниз и следуйте по пещере до тех пор, пока не достигнете главной внутренней части вражеского лагеря. Вдоль правой стороны пещеры вы найдете полки с хламом, которые следует убрать с дороги.

Рядом находится взрывающийся кувшин, возьмите кувшин и отнесите по тропе, которую вы только что открыли. Подойдя к заблокированной двери, бросьте кувшин в дверь, чтобы освободить путь. Двигайтесь в следующую часть пещеры и используйте плот и леса, чтобы добраться до ледяной стены. Разбейте её своим оружием, чтобы найти Книгу Знаний на другой стороне.

Состояние #3: Слиток
 ↑ 

Из локации, описанной выше, вернитесь в центральную комнату лагеря и переместите стопку хлама к краю платформы, рядом с водой. Прыгайте на платформу в центре комнаты, чтобы найти Слиток в сундуке.

Состояние #4: Слиток
 ↑ 

Этот Слиток можно найти на западе региона, в Доме берсерка. Обойдите дом и выстрелите в замок, закрывающий дверь через окно. Внутри дома вы найдете сундук.

Вот место с ключом:

Состояние #5: Слиток
 ↑ 

Это Состояние можно найти на западе Сноттингемшира в Стоунбурге. Поднимитесь вверх по большой круглой конструкции и спрыгните внутрь на второй уровень, чтобы найти сундук со Слитком.

Состояние #6: Слиток
 ↑ 

Этот Слиток можно найти в центре региона, на локации Манейская застава. Оказавшись внутри заставы, заберитесь на центральное строение и убейте врага внутри, чтобы получить Слиток.

Состояние #7: Слиток
 ↑ 

От Слитка, описанного выше, идите к двери, через которую вы вошли, и посмотрите направо, чтобы увидеть деревянный забор. Сломайте забор своим оружием, а затем пройдите вокруг, чтобы забрать Состояние из сундука.

Состояние #8: Слиток
 ↑ 

Это Состояние можно найти вдоль восточной границы региона, прямо вдоль реки Маун. Направляйтесь к большой хижине в задней части области и прыгайте через окно, чтобы найти сундук.

Состояние #9: Снаряжение – Плащ наставника (Снаряжение Ворона)
 ↑ 

Это Состояние также находится в том же лагере, что и Состояние #8. Его можно найти в маленькой хижине, к северу от большой.

Состояние #10: Слиток
 ↑ 

Этот Слиток можно найти в крепости, к северу от локации Наконечник копья. Поднимитесь на большую башню в этом форте и идите на небольшой балкон, ведущий в комнату. Внутри этой комнаты вы найдете Слиток. Вам нужно будет сначала убить всех врагов и забрать ключ у одного из них.

Состояние #11: Способность – Пинок Тюра (Оружие ближнего боя)
 ↑ 

Вернитесь к основанию крепости и поднимитесь к открытому окну с левой стороны здания. Внутри вы найдете способность.

Состояние #12: Слиток
 ↑ 

Этот Слиток можно найти рядом с Проклятым символом на юге региона в Миннинглоу. Сразу за лесом вы найдете пару пещер, ведущих вниз под холм. Зайдите в ту, что справа, и следуйте по пещере до конца. На полпути вы найдете ключ, проскользните под камень, чтобы поднять его, и двигайтесь вперед. В конце концов вы доберетесь до двери. Откройте ключом, чтобы найти сундук на другой стороне.

Состояние #13: Снаряжение – Маска наставника (Снаряжение Ворона)
 ↑ 

Это Состояние можно найти в Убежище в Шервуде. Двигайтесь в южную сторону лагеря и пролезьте через щель в заборе. Повернитесь налево и войдите в здание, чтобы найти сундук.

Состояние #14: Слиток
 ↑ 

Этот Слиток можно найти на окраине города Сноттингем. Здесь вы найдете колодец и, как и всегда, нужно разрушить крышку и прыгнуть внутрь, чтобы найти сундук.

Состояние #15: Запасы
 ↑ 

Эти запасы можно найти на южной оконечности региона, в Аббатстве Венлок. Вы увидите аббатство в городе, благодаря его большой структуре. Выполните набег и пусть ваши товарищи по команде помогут вам открыть дверь. Проделайте то же самое с дверью внутри аббатства, чтобы найти склеп. Спуститесь в него и убейте врагов, чтобы найти первый сундук.

Состояние #16: Запасы
 ↑ 

Эти запасы можно найти на южной оконечности региона, в Аббатстве Венлок. От сундука, описанного выше, спуститесь в склеп и убейте следующую группу врагов, чтобы найти сундук у стены.

Состояние #17: Запасы
 ↑ 

Эти запасы можно найти на южной оконечности региона, в Аббатстве Венлок. От сундука, описанного выше, посмотрите за угол, чтобы найти дыру в стене. Проскользните в нее и убейте оставшихся двух врагов, заберите ключ у одного из них. Откройте металлическую дверь в комнате и пройдите вперед. Убейте оставшихся врагов и откройте сундук в конце склепа.

Это 100% коллекционных предметов «Состояние», которые вы найдете в регионе Сноттингемшир в Assassin’s Creed Valhalla.

Где найти все багровые агаты в Genshin Impact?

В районе Драконьего Хребта в Genshin Impact можно найти 80 Багровых Агатов, и здесь вы найдете все локации и самый быстрый способ их собрать

Заснеженная тропа

Первый багровый агат появляется рядом с Frostbearing tree, когда вы его активируете.

На вершине дерева, рядом с каменными воротами.

На самой вершине небольшой горы.

Просто поверните направо от последней позиции Багрового Агата и скользите к следующей.

Убейте мобов в этой области, чтобы получить доступ к сундуку, спрятанному в хижине.


Древний Дворец

Парите в воздухе по кругу возле Статуи Семерых.

Вы должны победить парящего робота, чтобы активировать механизм и осушить бассейн там, где находится сундук.

Начните от Статуи Семерых в пещеру. Поверните направо, затем сломайте камень, преграждающий путь, или войдите на склоне горы.


Долина Драконьего Покоя

На вершине горы к северо-востоку от телепорта

К северу от последнего возьмите сначала Scarlet Quartz, а затем разбейте лед.

Находится к северу от телепорта. Вы можете просто скользить к нему оттуда.

Телепортируйтесь обратно в восточную точку пути в долине Драконьего Покоя и скользите к северо-западу, чтобы собрать Багровый агат на вершине кости дракона.

Продолжайте скользить к северо-западу, и вы найдете следующий Багровый агат в промежутке между дырой.

Телепортируйтесь в северную путевую точку Wyrmrest Valley и направляйтесь на северо-восток. Соберите 3 семени ветра, чтобы вызвать поток ветра.

С той же точки направляйтесь к ближайшей возвышенности и скользите к этому месту или соберите семена ветра, чтобы добраться до места Багрового Агата.

Победите 3 Фатуи, чтобы снять печать с драгоценного сундука.


Entombed City — окраина (север)

Возьмите алый кварц и поднимитесь на гору к северо-западу от телепорта, где находится замороженный багровый агат.

Вам нужно решить загадку здесь, чтобы получить Драгоценный сундук и получить доступ к нижней части этой области. Посмотрите на изображение слева, чтобы узнать, как решить загадку.

Найдете его на кончике сосульки после завершения головоломки.

В сундуке награда после решения загадки давления, расположенной к западу от арены.

Приведите сюда свою лучшую команду и пройдите гонку на время, чтобы открыть сундук.

 Над деревьями.

Победите Хилихурлов здесь, чтобы открыть сундук.

Победите Морозного Лавахурла, чтобы создать драгоценный сундук.


Entombed City — окраины (восток)

Активируйте 4 крио-памятника, чтобы осушить бассейн, в котором за обломками спрятан Багровый агат.

Второй Багровый Агат в клетке. Используйте Алый кварц, чтобы разбить лед с помощью скрытого механизма, чтобы получить его.

На вершине горы.

Сползите вниз и победите членов Fatui, чтобы открыть драгоценный сундук.

Пройдите испытание на время в ветре, чтобы получить драгоценный сундук.

Расположен к северу от испытания на время.

Победите Морозного Лавахурла, чтобы создать Роскошный сундук.

Между двумя морозными хилихурлами.

На вершине горы.


Пещера звездного сияния

 Посередине круговой структуры рядом с телепортом.

Расположен на вершине горы к юго-востоку от телепорта.

Сундук с Багровым Агатом находится вне преграды. Вы можете скользить вниз, чтобы добраться до него.

Этот заперт за головоломкой 2 и битвой с руинным боссом, чтобы открыть сундуки.

Расположен высоко в воздухе, к югу от загадки 3 согревающих Благих. Вам нужно подняться на гору, а затем скользить к ней.


Пещера Звездного сияния — Юго-восток

Первый Crimson Agate находится в сундуке, который появится после победы над Frostarm Lawachurl.

Расположен наверху хижины.

На вершине арки руин.

На вершине горы скользите от телепорта.

В сундуке внутри хижины, охраняемой Хилихурлами.

В южной части острова. Победите Грейдера руин, чтобы открыть сундук.


Пещера Звездного сияния — Восток

Парите над водой возле телепорта. Плавайте и используйте ледяные блоки, чтобы добраться до него.

Расположен на вершине дерева к северу от телепорта.

Запертый за головоломкой, вам нужно зажечь огонь таким образом, чтобы сили коснулся запертой колонны. Посмотрите на изображение слева, чтобы узнать, как решить загадку.

Вам нужно собрать 3 рваных записи, чтобы открыть сундук с Багровым агатом.


Древний дворец — юго-восток

Паря в воздухе, вы можете скользить со Статуи Семерых или с уступа возле секретной комнаты.

На вершине горы.

Вызовите Великого короля сноубордистов, затем победите его, чтобы открыть сундук.

Парите над входом в пещеру.

Победите Хилихурлов, чтобы открыть сундук с Багровым агатом.

Проплывите внутри небольшого туннеля.

Соберите 3 семени ветра, чтобы взлететь и схватить Багровый агат.

На краю обрыва к югу от ущелья Дадуапа есть Алый кварц. Используйте его, чтобы открыть сундук.


Skyfrost Nail — Под землей

Этот заперт за квестом, где вам нужно найти все 3 секретных ящика, чтобы открыть секретную комнату.

Плавание под ледяным мостом. Скользите вниз, чтобы добраться до него.

В середине сломанной центральной стойки.

Под ледяной глыбой.

Поднимитесь на край вершины. Вы можете использовать семена ветра, чтобы поднять себе настроение.

Сползите вниз, чтобы добраться до парящего багрового агата под ледяным мостом.


Небесный гвоздь

С этого момента вам нужно проходить свой квест в горах, чтобы получить весь оставшиеся Багровые Агаты.

Получите после того, как вы добьетесь прогресса в «Горном приключении» после преодоления ветров, преграждающих путь к вершине.

В сундуке награда.


Skyfrost Nail — Центр

Сверху сломанный столб.

Разблокируйте клетку, нажав 2 переключателя. Используйте ближайший алый кварц, чтобы разбить ледяной ком.

На верхней части тяготение столба.

Победите Морозного Лавахурла.

Парите высоко в воздухе. Активируйте тотем Анемо и скользите к локации Багровый Агат.


Небесный ледяной гвоздь — Саммит

Продолжайте подниматься вверх и найдите сломанную круглую башню.

Продолжайте подниматься, чтобы найти сундук с Багровым Агатом.

На вершине горы.

Просто активируйте Тотем Анемо

Парите в воздухе на южной стороне горы.

Этот Багровый Агат доступен только после активации 8 каменных скрижалей


Локация Скрытого Багрового Агата

Чтобы получить 80-й Багровый агат, вам нужно сначала выполнить локальный квест под названием «Затерянные в снегу». Это часть локального квеста в Genshin Impact, и его необходимо выполнить, чтобы получить весь 80-й Багровый агат и разблокировать скрытое достижение «Untellable Tale».

Эта миссия действительно проста, и вам не нужно разгадывать головоломки или сражаться с врагами. Вам просто нужно побегать по региону и найти все 3 кемпинга с запиской.

Активация квеста

Телепортируйтесь к путевой точке Виндволл Хайленд и поговорите с Джоэлем, маленьким NPC в лагере авантюристов, чтобы помочь ему найти своего отца и начать локальный квест.

После активации квеста вам нужно найти 3 записки, спрятанные по всему региону Драконьего Хребта.

В поисках отца Иоиля

1. Телепортируйтесь к Статуе Семерых в Драконьем Шпине и скользите вниз на юго-восток, чтобы прочитать первую аккуратно написанную заметку на земле.

2. Телепортируйтесь в Entombed City — окраину юго-восточной точки маршрута и направляйтесь на северо-запад и используйте атаку поджигателя, чтобы растопить снег, покрывающий второй Neatly-Written на земле, чтобы прочитать его.

3. Телепортируйтесь к Статуе Семерых в Драконьем Шпине и направляйтесь на юго-запад. Разбейте каменную стену, чтобы расчистить путь, и прочитайте каракули на месте лагеря.

Теперь вы можете взаимодействовать с миской рядом с ней и положить 2 ягоды, чтобы кормить лисиц в этой области. Повторяйте это в течение 2-5 дней в реальной жизни, пока не появятся 3 лисы с сундуком, содержащим Багровый агат.

Обязательно вернитесь и поговорите с Джоэлом, когда завершите квест.

Что такое малиновое желание

Crimson Wish — это новая функция, добавленная в обновления 1.2 относительно региона Драконий хребет, которая, если вы разбудите дерево возле Статуи Семи, затем перейдите к наградам, где вы можете увидеть, что предложение уровня 8 открывает Crimson Wish. По сути, это вызов, который вы можете выполнять два раза в неделю, и он обновляется каждый понедельник и пятницу.

За каждое выполненное малиновое желание вы получите 1 малиновый агат. Большинство задач аналогичны ежедневным заданиям, связанным с убийством мобов. Это единственный способ получить больше Багровых агатов, если вы уже нашли все 80 частей. Как только вы достигнете максимального уровня Frostbearing Tree, проблемы также перестанут появляться.

Ведьмак 3: “Игры с корчмарями”

В Ведьмак 3: “Игры с корчмарями” — необязательный для прохождения квест, в котором Геральту необходимо заполучить три уникальные карты для гвинта, выиграв в партии с тремя владельцами таверен.

Если вы хотите получить достижение “Собиратель карт”, то данный квест является обязательным для завершения.

Как начать задание

Для того чтобы начать квест “Гвинт: Игры с корчмарями” в Ведьмак 3, есть два варианта:

  1. Победить у школяра в Белом саду, тогда задание автоматически появится в журнале.
  2. Отправиться к доске объявлений в Оксенфурте и найти там записку от Штепана с приглашением опытных игроков сыграть в партию гвинта.

Битва со Штепаном в “Алхимии”

Этот корчмарь обитает в “Алхимии”, что находится в центре Оксенфурта. Довольно сильный противник, использующий Колоду Нильфгаарда. Мужчину будет сложно победить, если у вас нет хорошей колоды.

Основная его тактика:

  1. Использует карту “Эмгыр вар Эмрейс: Белое пламя”, которая нейтрализует способности вашего лидера.
  2. Применяет активно шпионов, медиков и отвлекающие карты, например, Чучело.

После того как победа будет одержана ведьмак получит уникальную карточку Йеннифэр из Венгерберга. Относится к классу Героев с силой 7 и лечащей способностью.

После этого Штепан посоветует сразиться Геральту со следующим двумя корчмарями для получения уникальных карточек.

Видео-пример боя со Штепаном в “Алхимии” с объяснениями:

Битва в таверне “На распутье”

Следующий противником является корчмарь из таверны “На распутье”, где ведьмак довольно часто бывает по мере прохождения основной игры.

Особенности боя с ним:

  • Использует Колоду Нильфгаард.
  • Лидер — Эмгыр вар Эмрейс: Император Нильфгаарда, позволяющий просмотреть 3 случайные карточки противника, то есть Геральта.
  • Активно использует медиков и шпионов.

Бой с ним окажется более легким, чем со Штепаном. После победы Геральт получит уникальную карту — Менно Коегоорн (Фракция Нильфгаард). Относится к классу Героев с медицинским уклоном + обладает силой 10.

Видео-пример боя в таверне “На распутье”, который поможет понять тактику противника во время партии:

Битва с Оливером в “Зимородок”

Остается последний противник, обитающий в таверне “Зимородок”, что расположена на Площади Иерархов в Новиграде.

К чему нужно быть готовым во время битвы с Оливером:

  1. Использует Колоду Чудовища в отличие от двух предыдущих противников.
  2. Лидер — Эредин Бреакк Глас: Король Aen Elle — удваивает силу отрядов ближнего боя.
  3. Спамит рукопашными отрядами.

После того как победа одержана, Геральт получает в награду уникальную карту-героя из нильфгаардской колоды — Тибора Эггебрахта. Относится к дальнобойным отрядам с силой 10.

Выиграть карту в корчме “Зимородок” в Ведьмак 3 можно и более простым способом. Если вы уже прошли задание “Сейчас или никогда” и спасли 2 чародеев, то уникальную карточку можно найти в подсобке в одном из двух мест:

  • в сундучке на шкафу,
  • в комоде.

Причина кроется в том, что, к сожалению, добродушного Оливера убьют охотники на колдуньями, и сыграть с ним  уже не получится.

Заходим в дверь справа от стойки Проверяем сундук на шкафу И комод И находим «Тибора Эггебрахта»

Видео-пример битвы с Оливером в “Зимородке”, если хотите изучить его тактику ведения партии:

Структурные данные о машинах для изъятия рептаренавирусов

Abstract

Отрывание крышки было впервые обнаружено у вируса гриппа. Структуры вовлеченных доменов полимеразы вируса гриппа, а именно эндонуклеазы в субъединице PA и кэп-связывающего домена в субъединице PB2, были решены. Эндонуклеазы, захватывающие кэп, также были продемонстрированы на самом N-конце L белков маммарены, ортобунии и хантавирусов. Однако до сих пор не идентифицирован кэп-связывающий домен в белке L арены или буньявируса.Мы решили структуру 326 C-концевых остатков L-белка вируса Калифорнийской академии наук (CASV), рептаренавируса, с помощью рентгеновской кристаллографии. Отдельные домены этого 37-кДа фрагмента (L-Cterm), а также расположение доменов структурно сходны с кэп-связывающими и соседними доменами субъединицы полимеразы вируса гриппа PB2, несмотря на отсутствие гомологии последовательностей, что предполагает общее эволюционное происхождение. . Это позволило идентифицировать область в CASV L-Cterm, сходную с сайтом связывания кэпа; однако типичный бутерброд из двух ароматических остатков отсутствовал.В соответствии с этим связывание кэпа с CASV L-Cterm не может быть обнаружено биохимически. Кроме того, мы решили кристаллическую структуру соответствующей эндонуклеазы на N-конце белка L CASV. Он показывает типичную эндонуклеазную складку с конфигурацией активного сайта, которая по существу идентична структуре известных эндонуклеазных структур маммаренавируса. В заключение мы приводим доказательства предположительно функциональной эндонуклеазы, захватывающей кэп, на N-конце и вырожденного домена, связывающего кэп, на С-конце белка L рептаренавируса.Обсуждаются последствия этих открытий для механизма захвата крышек у аренавирусов.

Информация об авторе

Аренавирусы распространены по всему миру и могут вызывать тяжелую, часто смертельную геморрагическую лихорадку у людей. Вакцины и эффективные методы лечения отсутствуют. Аренавирусы реплицируются в цитоплазме инфицированных клеток, и, поскольку они не могут синтезировать кэп-структуры, они используют механизм, называемый захватом кэпов, для похищения кэп-структур с мРНК хозяина для транскрипции вируса. Этот механизм является привлекательной мишенью для лекарств, поскольку он важен для репликации вируса и специфичен для вируса.Однако аренавирусные компоненты этого механизма плохо определены по сравнению с вирусом гриппа, прототипическим вирусом, снимающим колпачок. Мы представляем первые кристаллические структуры двух предполагаемых компонентов механизма захвата аренавирусов Калифорнийской академии наук, а именно изолированные N- и C-концы вирусной РНК-полимеразы (L-белок). На N-конце находится то, что выглядит как функциональная эндонуклеаза, захватывающая кэп. С-конец L-белка, несмотря на полное расхождение последовательностей, демонстрирует общее структурное сходство с С-концевым участком субъединицы полимеразы вируса гриппа PB2, что указывает на общее эволюционное происхождение.Присутствует домен, явно связанный с доменом связывания кэпа PB2, хотя связывание кэпа не может быть продемонстрировано биохимически. Определенные структуры обеспечивают основу для будущих исследований, направленных на раскрытие деталей механизма захвата крышек аренавируса и его потенциала в качестве мишени для разработки лекарств.

Образец цитирования: Rosenthal M, Gogrefe N, Vogel D, Reguera J, Rauschenberger B, Cusack S, et al. (2017) Структурные представления о механизмах захвата рептаренавирусов.PLoS Pathog 13 (5): e1006400. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400

Редактор: Шон П.Дж. Уилан, Гарвардская медицинская школа, США

Поступила: 15 января 2017 г .; Принята к печати: 5 мая 2017 г .; Опубликован: 15 мая 2017 г.

Авторские права: © 2017 Rosenthal et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и файлах с вспомогательной информацией или доступны в базе данных PDB (номера доступа 5MUS, 5MUY, 5MUZ и 5MV0).

Финансирование: Эта работа финансировалась грантами Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, http://www.dfg.de): RE 3712 / 1-1 для SR и GU 883 / 1-1 и GU 883/4 -1 к SG. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Семейство аренавирусов делится на два рода: маммаренавирусы и рептаренавирусы. За исключением вируса Такарибе, грызуны считаются естественными резервуарами маммаренавирусов. Рептаренавирусы были обнаружены только у содержащихся в неволе змей [1]. Некоторые аренавирусы, такие как вирус Ласса (LASV), вирус Хунина и вирус Мачупо, могут вызывать тяжелые заболевания человека с геморрагическими и неврологическими симптомами.На сегодняшний день единственным лекарством, доступным для лечения аренавирусных инфекций, является рибавирин, который предположительно нацелен на вирусную репликацию [2].

Аренавирусы представляют собой частицы в оболочке, которые содержат два одноцепочечных сегмента отрицательной смысловой РНК. Два сегмента генома кодируют четыре вирусных белка, нуклеопротеин (NP), гликопротеин-предшественник, малый матричный белок Z и большой белок L> 200 кДа, который содержит вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу. Минимальными вирусными компонентами для репликации и транскрипции генома являются вирусная РНК, NP и белок L [3].Белок L синтезирует два различных вида РНК: (i) антигеномную и геномную РНК как продукты репликации генома и (ii) более короткие кэпированные вирусные мРНК во время транскрипции. Предположительно, чтобы инициировать вирусную транскрипцию, белок L использует процесс, называемый захватом крышки. Предполагается, что белок L расщепляет мРНК клетки-хозяина ниже 5′-кэп-структуры и использует эту короткую кэпированную РНК в качестве праймера для синтеза вирусной мРНК. В соответствии с этой гипотезой 4–5 нетемплатированных нуклеотидов обнаруживаются на 5′-концах вирусных мРНК, а в N-концевой области L-белка присутствует эндонуклеаза [4–7].Прототипом вирусов, захватывающих кэп, является вирус гриппа [8], который содержит эндонуклеазу в субъединице PA вирусной полимеразы, а также сайт связывания кэпа в субъединице PB2 [9–11]. Учитывая филогенетическое родство и сходство в цикле репликации ортомиксовирусов и аренавирусов – оба являются сегментированными вирусами с РНК с отрицательной цепью – разумно предположить, что белок L аренавируса также имеет сайт связывания кэпа, хотя прямых доказательств этого нет. [12]. Предыдущие функциональные данные, полученные с помощью репликонной системы LASV, позволили предположить, что сайт связывания кэпа может располагаться на С-конце белка L [13].

Чтобы дополнительно охарактеризовать механизм захвата кепки аренавирусов, мы попытались решить структуру N- и C-концевых доменов L белков различных аренавирусов. В конце концов, мы добились успеха с L-белком вируса Калифорнийской академии наук (CASV), который является рептаренавирусом. Здесь мы представляем кристаллические структуры двух концевых доменов белка L CASV: эндонуклеазы, захватывающей кэп, на N-конце и 326 C-концевых остатков, которые, по аналогии с LASV, могут играть роль в транскрипции [13 ].Активный сайт эндонуклеазы почти идентичен другим родственным ферментам, что позволяет предположить, что рептаренавирусы используют механизм захвата кэпа для синтеза мРНК. С-концевой домен структурно связан с белком PB2 вируса гриппа и имеет предполагаемый нефункциональный сайт связывания кэпа. Мы размышляем о его роли в механизме захвата кепки аренавирусов и обсуждаем наши данные в контексте доступных структурных и функциональных данных из других сегментированных вирусов с отрицательной цепью РНК.

Результаты

Дизайн конструкции и скрининг растворимости С-концевых фрагментов белка L аренавируса

Чтобы получить фрагменты растворимого белка С-концевого домена, мы клонировали и протестировали более 120 различных фрагментов белка L из 20 видов аренавирусов, охватывающих широкий филогенетический спектр для растворимой экспрессии в Escherichia coli (см. Таблицу S3). Первоначально пятнадцать процентов белков были растворимы. Растворимые кандидаты очищали аффинной никелевой хроматографией и эксклюзионной хроматографией и тестировали на стабильность.Около пяти процентов фрагментов были монодисперсными и стабильными и использовались для испытаний по кристаллизации. Оптимизация экспрессируемых фрагментов с использованием биоинформатики, ограниченного протеолиза и анализов термостабильности привела к C-концевым 326 аминокислотам белка L CASV (остатки 1721-2046; нумерация остатков относится к полноразмерному белку L) с N-концевым His -тэг как лучший кандидат для определения структуры.

Структура C-конца белка L CASV

После расщепления His-tag очищенный белок, меченный селено-метионином, был успешно кристаллизован, и структура была решена с использованием метода единственного аномального диспергирования.Белок (называемый CASV L-Cterm) кристаллизовался в пространственной группе P2 1 2 1 2 1 с двумя молекулами на асимметричную единицу, и структура могла быть уточнена с разрешением 2 Å (рис. 1A и 1B, S1 Таблица). За исключением остатков 1748, 1762 и 1768 в цепи A и области, содержащей остатки 2034-2040 в цепи B, для структуры наблюдалась чистая электронная плотность. Белок кристаллизовался в виде димера, который не является полностью симметричным. Единственное заметное различие между мономерами заключается в гибких петлях, соединяющих два описанных ниже домена.Эта димерная форма также наблюдается в растворе, что выявлено с помощью эксклюзионной хроматографии и измерений SAXS (рис. 1C, S1A, рис.). Белковый мономер имеет U-образную форму и состоит из двух отдельных доменов: (i) преимущественно α-спирального домена (домен 1), состоящего из остатков 1721–1793 и 1894–2046 с длинным C-концевым хвостом, и (ii) домена (домен 2), состоящий из большого β-листа, а также одной длинной и двух коротких α-спиралей (остатки 1794–1894) (рис. 1B, синий и зеленый соответственно). Второй домен вставлен в последовательность первого, и оба домена соединены двумя длинными гибкими линкерами без каких-либо дополнительных контактов.

Рис. 1. Атомная структура CASV L-Cterm.

A) Структура димера белка в асимметричной единице показана в виде ленточной диаграммы спереди и сбоку. Цепочка A окрашена в синий и зеленый цвета, цепочка B – в темно-серый и светло-серый цвета. Помечены N- и C-концы. B) Цепь A показана в виде ленточной диаграммы. Помечены N- и C-концы. Домен 1 показан синим цветом, домен 2 – зеленым. C) Наложение формы молекулы, полученной из SAXS, на кристаллическую структуру (ленточная диаграмма) подтверждает димерную конформацию белка при концентрации 1 мг / мл в растворе.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.g001

В кристаллизованном димере два U-образных мономера сцепляются друг с другом, образуя кольцо с отверстием посередине с площадью скрытой поверхности приблизительно 3000 Å 2 между мономерами. Наиболее интенсивные межмолекулярные контакты происходят между 40 самыми С-концевыми остатками каждой цепи (площадь скрытой поверхности 1100 Å 2 ).

Поиск сходства на основе структуры для выявления возможных функций

Чтобы идентифицировать известные структурные гомологи нашей структуры, мы использовали программу DALI для сравнения структур белков [14] и выполнили поиск по всему мономеру и по двум доменам по отдельности.Для преимущественно α-спирального домена 1 не удалось идентифицировать значимое попадание. Результаты включали различные белки, такие как экспортины, импортины, протеинфосфатазы, белки, связанные с цитоскелетом, глутатион-S-трансферазу, а также субъединицу eIF4G фактора инициации трансляции эукариот 4F. Все эти совпадения имели очень низкие Z-баллы (<4,6) и не имели убедительного структурного сходства с L-Cterm.

Интересно, что для домена 2 L-Cterm список содержал кэп-связывающий домен PB2 вируса гриппа, который также был обнаружен при использовании полного мономера L-Cterm CASV в качестве модели поиска.Другими попаданиями для домена 2 были ацетилтрансферазы, сульфатазы, метилтрансферазы, β-лактамазы и связывающие ТАТА-боксы белки, опять же с относительно низкими Z-баллами (<5,0).

Структурное сходство между CASV L-Cterm и вирусом гриппа PB2

Несмотря на полное отсутствие гомологии последовательностей, CASV L-Cterm и грипп PB2 демонстрируют замечательное сходство в общей архитектуре домена и топологии субдомена (рис. 2 и 3, домены PB2 вируса гриппа нарисованы в соответствии со структурой из ссылки).[15]). Во-первых, часть I домена 1 L-Cterm CASV (остатки 1721–1790) подобна среднему домену PB2 вируса гриппа. Оба состоят из четырех α-спиралей, за которыми следует петля, соединяющаяся с доменом 2 L-Cterm или кэп-связывающим доменом PB2, соответственно (рис. 2В и 3). Во-вторых, часть II L-Cterm-домена 1 (остатки 1896-1924) подобна связывающей области PB2; оба содержат трехцепочечный β-лист (рис. 2B, 2D и 3). В-третьих, часть III L-Cterm-домена 1 (остатки 1925–2046) соответствует 627-домену PB2.Обе области содержат α-спиральный пучок, за которым следует небольшой четырехцепочечный β-лист, хотя и в разной ориентации (Рис. 2D). Только кислый C-концевой хвост CASV L-Cterm (см. Также S2 и S10 фиг.) Отсутствует у вируса гриппа, который вместо этого имеет небольшой домен, содержащий последовательность терминальной ядерной локализации.

Рис. 2. Сравнение структуры CASV L-Cterm со структурой вируса гриппа PB2 (PDB ID 5FMM).

A) Сравнение доменов в PB2 и L-Cterm.Идентификаторы участков внутри белка показаны в столбцах. Домен 1 (D1) L-Cterm разделен на три части (D1-I, D1-II и D1-III). Линкеры к домену 2 или кэп-связывающему домену окрашены в желтый цвет. Под полосами указаны номера остатков разноцветных областей. Помечены N- и C-концы. Отсутствующие на рисунке C-концевые части PB2 обозначены пунктирными линиями. B) Структуры частей I и II домена L-Cterm 1 (левая панель) и доменов среднего звена PB2 (правая панель) показаны в виде ленточных диаграмм.Цвета имеют кодировку, представленную в A). Линкеры к домену 2 и кэп-связывающему домену показаны желтым цветом. N-концы помечены. C) Сравнение домена 2 L-Cterm (левая панель) с доменом связывания кэп PB2 (правая панель) со структурами, представленными в виде ленточных диаграмм. Конструктивно похожие элементы имеют похожие цвета. Ссылки на другие домены выделены желтым цветом. D) Структурное сравнение частей II и III домена L-Cterm 1 (левая панель) и доменов link-627 PB2 (правая панель).Структуры показаны в виде ленточных диаграмм. Цвета обозначены как в А). β-цепи части III L-Cterm домена 1 и 627-домена PB2 окрашены в красный цвет. С-концы помечены.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.g002

Рис. 3. Топологический обзор структур CASV L-Cterm и PB2 вируса гриппа.

Схематическое изображение общей доменной архитектуры A) CASV L-Cterm домен 1 – части I и II (окрашены в синий и бирюзовый цвета соответственно) и домен 2 (окрашены в зеленый цвет), а также B) мид-домен PB2 вируса гриппа (синий), кэп-связывающий домен (зеленый) и линкерный домен (бирюзовый).α-Спирали показаны как цилиндры, β-тяжи – как большие стрелки. N-концы помечены, а белковые части, которые следуют за представленными доменами, обозначены маленькой стрелкой с данными названиями.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.g003

Что наиболее важно, наибольшая степень сходства наблюдалась между доменом 2 L-Cterm и доменом связывания кэпа PB2 (рис. 2C). Оба образованы антипараллельным β-листом, упакованным против 3–4 α-спиралей. PB2 имеет структуру β-шпильки, вставленную между двумя цепями β-листа, которая отсутствует в домене 2 L-Cterm.Последний имеет только длинную петлю в гомологичном положении (рис. 2С и 3). В PB2 колпачок связан между F404, выступающим из конца длинной спирали (рис. 4A, правая панель, спираль показана светло-зеленым) и h457, расположенным в β-шпильке. Домен 2 L-Cterm также содержит ароматический остаток (Y1872) на конце гомологичной длинной спирали (фиг. 4A, левая панель), указывающий в том же направлении, что и F404 в PB2. Поскольку β-шпилька отсутствует в CASV L-Cterm, нет гомолога для остатка гистидина.Возможным кандидатом в L-Cterm для образования ароматического сэндвича, как видно в PB2 [9], может быть W1818, который выступает из второй β-цепи. Однако этот остаток не находится в конформации для образования ароматического сэндвича, как это видно в PB2. Гипотетические конформационные изменения, необходимые для того, чтобы боковая цепь W1818 участвовала в таком взаимодействии, невозможны в нашей структуре, поскольку P1810 из соседней петли тесно взаимодействует с W1818 и удерживает петлю и, следовательно, боковую цепь W1818 на месте (рис. 4C). .В заключение, домен L-Cterm 2 структурно подобен домену связывания кэпа PB2, хотя типичный ароматический сэндвич для связывания кэпа не является полным.

Рис. 4. Исследование кэп-связывания L-Cterm CASV в сравнении с PB2 вируса гриппа.

A) Сравнение домена 2 L-Cterm CASV (левая панель) с кэп-связывающим доменом PB2 (PDB ID 2VQZ, правая панель) со структурами, представленными в виде ленточных диаграмм. Конструктивно похожие элементы имеют одинаковый цвет. Потенциальные связывающие кэп ароматические остатки в CASV L-Cterm и фактические связывающие кэп остатки в PB2 показаны в виде полосок и окрашены в оранжевый цвет.Связано m 7 Молекулы GTP показаны в виде палочек. B) На рисунке показано связывание m 7 GTP с димером CASV L-Cterm в кристалле после экспериментов с пропиткой. Показаны обзор (слева) и крупный план (справа). CASV L-Cterm представлен в виде ленточной диаграммы, а остатки, относящиеся к связыванию, показаны в виде полосок. m 7 GTP показан в виде стержней, а окружающая электронная плотность (2 | Fo | – | Fc | карта на 2σ) – в виде синей сетки. C) Взаимодействие W1818 с P1810 из соседнего контура.Домен 2 CASV L-Cterm показан в виде зеленой ленточной диаграммы, потенциальные связывающие кэп остатки Y1872 и W1818 показаны оранжевыми полосками, а P1810 – синими полосками.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.g004

Помимо структурной организации изолированных доменов, их расположение в первичной структуре сохраняется между вирусом гриппа и CASV (рис. 2A и 3): в обоих PB2 и L-Cterm, кэп-связывающий домен и домен 2, соответственно, вставляются в полипептидную цепь в аналогичных положениях через два гибких линкера.

Исследования связывания кэп с CASV L-Cterm

Чтобы проверить, может ли CASV L-Cterm связываться с кэп-структурами, несмотря на неблагоприятное расположение ароматических остатков в кристалле, мы провели несколько экспериментов с использованием кэп-аналога m 7 GTP. Сначала кап-аналог пропитался кристаллами CASV L-Cterm. Однако электронная плотность не появлялась в полости, образованной Y1872, F1806 и W1818, то есть в положении, ожидаемом по сравнению с PB2 (рис. 4A и 4B).Вместо этого кэп-аналог был связан с F1839 на периферии β-слоя между двумя мономерами CASV L-Cterm. Не было обнаружено второго ароматического остатка ни в одной молекуле, связанной с симметрией, что позволяет предположить, что m 7 GTP не был связан аутентичным сайтом связывания кэпа. Фактически наблюдаемая электронная плотность не была ни сильной, ни покрывающей всю молекулу GTP m 7 (рис. 4B). Как уже упоминалось, димерная форма белка в кристалле не является полностью симметричной, и мы обнаружили, что m 7 GTP связывается только между доменом 2 цепи A и доменом 1 цепи B, где граница раздела немного более открыта по сравнению с интерфейс между доменом 2 цепочки B и доменом 1 цепочки A.Мы также протестировали кэп-связывающую способность CASV L-Cterm в m 7 GTP-агарозных анализах. Принимая во внимание, что PB2 и эукариотический фактор инициации 4E (eIF4E), эукариотический белок, связывающий кепку, связанный с m 7 GTP-агарозой, мы не смогли обнаружить связывание CASV L-Cterm (S6A фиг.). Кроме того, мы не смогли наблюдать влияние m 7 GTP на термостабильность CASV L-Cterm или связывание CASV L-Cterm с кэпированной РНК в анализе смещения радиоактивного геля (S7 и S6B фиг.).

Роль димеризации белка и домена 1 в функции связывания кэпа

Образование димера, наблюдаемое для CASV L-Cterm как в растворе, так и в кристалле, предположительно является артефактом из-за экспрессии изолированного С-концевого фрагмента L-белка и не существует в контексте полноразмерного L-белка.Поскольку предполагаемый сайт связывания кэпа находится близко к интерфейсу димера, мы проверили, может ли присутствие L-Cterm домена 1 и / или димеризация CASV L-Cterm препятствовать связыванию белка с m 7 GTP путем блокировки белок в неприродной конформации. С этой целью мы попытались заблокировать димеризацию L-Cterm. Мы проанализировали интерфейс димера и разработали мутантный белок, в котором отсутствуют C-концевые 14 остатков (deltaC). Эти в основном отрицательно заряженные остатки взаимодействуют с положительно заряженным участком на второй молекуле (S10 фиг.), Образуя одну треть границы раздела димера.Конструкция deltaC действительно была чисто мономерной согласно измерениям SAXS (S1C фиг.), Однако она не связывалась с m 7 GTP-агарозой (S6A фиг.) И не была термически стабилизирована m 7 GTP (S7 фиг.). Хотя слабое связывание с РНК наблюдалось в анализах сдвига геля, это сродство не было кэп-специфичным (S6B и S6C фиг.). Поэтому дальнейшие эксперименты с этим фрагментом не проводились.

Чтобы дополнительно подтвердить, что домен L-Cterm 1 не влияет на конформацию домена 2 L-Cterm, мы кристаллизовали и решили структуру изолированного домена 2 (рис. 5A, таблица S1).Эта структура была уточнена до разрешения 1,8 Å. CASV L-Cterm домен 2 также кристаллизовался в виде димера, но – из-за отсутствия домена 1 – с совершенно другим и гораздо меньшим интерфейсом по сравнению с CASV L-Cterm. Белок также проявлялся в виде димера в растворе, как показано методом SAXS (фиг. 5B и S1B). Наложение изолированного домена Cterm 2 на его аналог в полной структуре L-Cterm CASV показывает только небольшие различия в петле перед W1818 и отсутствие значительной перестройки потенциальных связывающих кэп боковых цепей, даже несмотря на то, что B-факторы относительно высоки вокруг предполагаемый сайт связывания кэпа (фиг. 5C и 5D).Совместная кристаллизация домена с m 7 GpppG, m 7 GTP, GTP или ATP не привела к дополнительной электронной плотности.

Рис. 5. Атомная структура изолированного домена CASV L-Cterm 2.

A) Ленточная диаграмма структуры домена 2 CASV L-Cterm. Цепь A показана бледно-зеленым цветом, цепь B – серым. N- и C-концы отмечены, а потенциальные связывающие кэп ароматические боковые цепи Y1872 и W1818 показаны в виде полосок и окрашены в оранжевый цвет. B) Наложение полученной методом SAXS молекулярной формы L-Cterm в концентрации 4.5 мг / мл и ленточная диаграмма кристаллической структуры. C) Наложение ленточных диаграмм цепочек A и B из изолированной кристаллической структуры CASV L-Cterm domain 2 (пурпурный и желтый, соответственно) и кристаллической структуры L-Cterm (зеленый). Потенциальные ароматические боковые цепи, связывающие кэп, выделены насыщенными цветами. D) Представление цепи B домена L-Cterm 2, окрашенного B-фактором, при этом наибольшее наблюдаемое значение B составляет 106 (оранжевый), а наименьшее 22 (темно-синий).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.ppat.1006400.g005

И снова мы не обнаружили связывания с m 7 GTP-агарозой изолированного домена 2 L-Cterm CASV (фиг. S6A), а также термостабилизации белка m 7 GTP (S7 Рис). Предполагая, что одной кэп-структуры может быть недостаточно для связывания, мы также провели эксперименты по связыванию в нативном геле с использованием кэпированной РНК. Мы обнаружили сдвиг РНК с PB2, но не с L-Cterm доменом 2 (S6B на фиг.).

Поскольку ни мономерная форма CASV L-Cterm (deltaC), ни димерная форма с другим димерным интерфейсом (домен 2) не связывает m 7 GTP, мы заключаем, что димеризация белка и присутствие домена 1 не ответственны за отсутствие активности связывания кэп.

Определение структуры эндонуклеазы CASV

Механизм захвата кэпа был предложен и охарактеризован до сих пор только для маммаренавирусов на основании (i) результатов секвенирования, показывающих 4–5 нестандартных нуклеотидов на 5′-конце вирусной мРНК, и (ii) структурных и функциональных данных, демонстрирующих существование эндонуклеазы на N-конце белка L [4, 5, 16]. Таким образом, мы стремились предоставить дополнительные доказательства механизма захвата крышки у рептаренавирусов.Мы сосредоточились на N-конце белка L, где должна располагаться эндонуклеаза.

При выравнивании последовательностей N-концов белка L аренавируса было обнаружено, что ключевые остатки активного сайта эндонуклеазы являются высококонсервативными во всем семействе вирусов, даже в рептаренавирусах (S8 фиг.). Таким образом, мы экспрессировали и очистили первые 205 остатков белка L CASV в виде белка, меченного His на N-конце. Как и ожидалось, исходя из металлзависимого ферментативного механизма вирусных эндонуклеаз, анализы термостабильности показали зависящую от концентрации стабилизацию белка ионами марганца с повышением температуры плавления до ~ 10 ° C при концентрации 10 мМ марганца (концентрация белка в пробирке 4.2 мкМ) (рис. 6D). После расщепления His-tag белок кристаллизовался, и кристаллы дифрагировали с разрешением 1,9 Å. Молекулярная замена с использованием любой из трех известных структур эндонуклеаз аренавируса или их субдоменов в качестве моделей поиска не увенчалась успехом. Поэтому мы экспрессировали белок селенометионинами и кристаллизовали его после расщепления His-tag в присутствии ионов марганца. Фазы были определены с использованием метода одиночной аномальной дисперсии и использованы для решения структуры с набором данных из лучших дифрагирующих собственных кристаллов.Структура уточнена до разрешения 1,9 Å. Нативный белок кристаллизовался в пространственной группе P2 1 2 1 2 1 с четырьмя молекулами на асимметричную единицу. Структуры четырех молекул очень похожи с единственной разницей в 15 остатках на С-конце, которые не видны во всех молекулах (среднеквадратичное отклонение от 0,227 до 0,317 Å). Эндонуклеаза CASV имеет в основном такую ​​же укладку, что и эндонуклеазы из LASV, вируса Pichinde (PICV) и вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) (рис. 6A и 6B, таблица S1), хотя аминокислотная последовательность этого белка вряд ли сохраняется среди этих вирусов. (идентичность от 20 до 55% и сходство от 54 до 79%, S11 рис.).Небольшие различия между структурами наблюдались в длинной α-спирали, параллельной β-листу (рис. 6A и 6B, α-спираль показана оранжевым), которая разделена на две спирали в домене эндонуклеазы CASV по сравнению с другими структурами, так как а также в спиральной области, показанной зеленым цветом, которая состоит из четырех-шести спиралей разной длины и ориентации. RMSD между структурами находится в диапазоне от 1,372 Å (CASV по сравнению с LCMV) до 1,856 Å (CASV по сравнению с LASV). Высококонсервативные остатки активного сайта эндонуклеазы расположены так же, как и в других структурах эндонуклеазы аренавируса (фиг. 6E).Электростатический поверхностный потенциал эндонуклеазы CASV также сопоставим с другими эндонуклеазными структурами с положительно заряженными участками рядом с отрицательно заряженной полостью активного сайта (рис. 6C). Мы также тестировали на эндонуклеазную активность, используя ранее установленный анализ расщепления РНК [17], однако мы не наблюдали ферментативной активности изолированного домена (S9 Рис).

Рис. 6. Структура и термостабилизация эндонуклеазы CASV.

A) Ленточная диаграмма кристаллической структуры эндонуклеазы CASV.N- и C-концы помечены, а остатки активного сайта показаны в виде стержней. Консервативный β-лист и длинная α-спираль окрашены в оранжевый цвет, консервативный домен спирального пучка – в зеленый, а оставшаяся часть с петлями и α-спиралями – в желтый. B) Структуры эндонуклеаз LASV (PDB ID 5J1P), LCMV (PDB ID 3JSB) и PICV (PDB ID 4I1T) показаны в виде ленточных диаграмм и окрашены в соответствии с эндонуклеазой CASV на A). Ионы марганца LASV-структуры 5J1P показаны красными сферами, остатки активного центра показаны стержнями, а N- и C-концы отмечены. C) Электростатический поверхностный потенциал эндонуклеазных структур, показанных на A) и B). Поверхностный потенциал показан от -5 KT / e красным цветом до +5 KT / e синим и был рассчитан с использованием PDB2PQR и APBS-инструмента PyMOL. D) Температурная стабильность эндонуклеазы CASV в зависимости от концентрации Mn 2+ . Температуры плавления представлены как среднее значение и стандартное отклонение трех независимых измерений. Стабильность белка тестировали в присутствии различных концентраций Mn 2+ и в присутствии 10 мМ EDTA. E) Крупным планом наложенные активные сайты эндонуклеаз структур, показанных на A) и B). Консервативные остатки активного сайта показаны в виде стержней, а ионы марганца со структурой 5J1P LASV показаны красными сферами.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.g006

Обсуждение

Отрывание крышки было впервые обнаружено у вируса гриппа [8]. Структуры отдельных ответственных доменов, а именно эндонуклеазы в PA и кэп-связывающего домена в PB2, были решены [9–11].На основании структуры полной полимеразы вируса гриппа был предложен механизм захвата кэпа и зависимой от кэп транскрипции [18]. Механизм захвата крышки является привлекательной мишенью для лекарств, поскольку соответствующие функциональные домены полимеразы являются как важными, так и вирусоспецифичными. После идентификации нетематических производных от хозяина последовательностей на 5′-концах мРНК других сегментированных вирусов РНК с отрицательной цепью было высказано предположение, что захват кэпа является обычным механизмом для этих вирусов [4, 6, 7, 19-24].Однако, в отличие от эндонуклеазы, которая, как недавно было показано, расположена на самом N-конце L-белка маммарена-, ортобуниа и хантавирусов с использованием структурных и молекулярно-биологических методов [5, 16, 17, 25, 26], кэп-связывающий домен до сих пор не был идентифицирован ни у одного арено- или буньявируса.

Мы выяснили структуру 326 С-концевых остатков белка L рептаренавируса. Несмотря на отсутствие какой-либо значительной гомологии последовательностей, домены этого фрагмента 37 кДа структурно подобны кэп-связывающим и соседним доменам вируса гриппа PB2 [15].Оба белка имеют общую архитектуру в отношении линейного расположения доменов и элементов вторичной структуры. Наибольшая степень сходства наблюдается между кэп-связывающим доменом PB2 и доменом 2 L-Cterm. Сравнение этих двух доменов привело нас к идентификации потенциального сайта связывания кэпа в L-Cterm. Однако этот сайт не имеет типичного сэндвича из двух ароматических остатков [27]. Хотя один ароматический остаток (Y1872) находится в положении, аналогичном его предполагаемому гомологу в PB2, шпилька, которая обеспечивает второй ароматический остаток в PB2, отсутствует в CASV.Несколько попыток биохимической или структурной проверки наличия функционального сайта связывания кэпа не увенчались успехом. Кроме того, мы решили кристаллическую структуру соответствующей эндонуклеазы на N-конце белка L рептаренавируса. Он показывает типичную эндонуклеазную складку, обнаруженную в других сегментированных вирусах с отрицательной цепью РНК, и топологию активного сайта, которая по существу идентична таковой у известных эндонуклеазных структур маммаренавируса [5, 10, 17, 26, 28].

Главный вопрос, возникающий из этих данных, заключается в том, содержит ли L-белок CASV – и, следовательно, L-белок других аренавирусов – функциональную машину, отрывающую кэп, как это описано для полимеразы вируса гриппа? Из экспериментов с репликонными системами для LASV и LCMV ясно видно, что эндонуклеаза на N-конце белка L важна для транскрипции вируса [5, 25].Структуры, полученные для эндонуклеазных доменов LASV и LCMV, в частности, конформация активных центров, указывают на существование функционального фермента, даже несмотря на то, что каталитическая активность выделенных доменов отсутствует или низкая по сравнению с эндонуклеазами вируса гриппа или буньявирусов [5, 10, 17, 26]. Консервативная топология активного сайта в структуре эндонуклеазы CASV и стабилизация белка с помощью Mn 2+ являются сильными аргументами в пользу присутствия функциональной эндонуклеазы в белке L рептаренавирусов, даже если она идентична изолированному эндонуклеазному домену LASV. , биохимическая активность нуклеаз не определялась [26].Как показано для эндонуклеазы вируса гриппа, возможна активация фермента в контексте полного L-белка, отчасти из-за усиленного связывания РНК [15]. К сожалению, мы не можем предоставить функциональные данные об участии эндонуклеазы CASV в вирусной транскрипции, так как системы репликонов для рептаренавирусов недоступны. Тем не менее, в сочетании с имеющимися данными по маммаренавирусам [5, 16, 25, 26] мы считаем структурные данные, представленные здесь, достаточными, чтобы утверждать о существовании эндонуклеазы, захватывающей кепку, в рептаренавирусах, даже без биохимических доказательств.

В отличие от эндонуклеазы, как структурные, так и биохимические данные предполагают, что предполагаемый сайт связывания кэпа на С-конце белка L CASV не является функциональным. Данные, полученные с мутантом с дефицитом димеризации и изолированным доменом 2 L-Cterm, исключают, что взаимодействие между доменами 1 и 2 на границе димеризации объясняет отсутствие функционального сайта связывания кэпа.

Мы также не смогли продемонстрировать ни связывание C-концевых фрагментов белка L маммаренавирусов с m 7 GTP или кэпированной РНК, ни термостабилизацию этих белков с помощью m 7 GTP (показано для растворимого фрагмента L-Cterm LASV в S6 и S7 фиг.), что указывает на то, что неспособность связывать кэп-структуры не является специфической для CASV.

В предыдущем исследовании мы идентифицировали несколько аминокислотных остатков на C-конце белка LASV L, которые имеют решающее значение для вирусной транскрипции, но необходимы для репликации генома [13]. Однако присутствие сайта связывания кэпа не могло быть предположено, так как не существует мотива, облегчающего его идентификацию на уровне последовательности [27]. Чтобы сопоставить эти функциональные данные из LASV с нашей атомной структурой CASV L-Cterm, мы попытались выровнять первичные последовательности обоих белков. К сожалению, это было невозможно из-за чрезвычайно низкой консервативности последовательности на С-конце белков аренавируса L (S12, фиг.).Поэтому мы использовали предсказанные вторичные структуры C-концов LASV и других белков L аренавируса [29–31] вместе с определенной вторичной структурой из кристаллических структур PB2 вируса гриппа и CASV L-Cterm в качестве руководства для предложения выравнивания последовательностей этих вирусы (S2 фиг.). Хотя это выравнивание следует интерпретировать с осторожностью, оно облегчило вывод LASV-аналогов остаткам белка L CASV, потенциально участвующим в связывании кэпа, и наоборот (S3 Fig). В частности, остаток F2042 в белке LASV L оказался лучшим кандидатом в гомолог Y1872 в белке L CASV и F404 в вирусе гриппа PB2.Мы протестировали различные мутанты LASV-белка с заменами в этом и соседних положениях в системе минирепликонов LASV (S3 и S4, фиг., S2, таблица). Наиболее важно то, что F2042 в LASV-белке может быть заменен полярным и гидрофильным серином без какого-либо влияния на транскрипционную активность L-белка. Этот фенотип несовместим с функцией этого остатка в ароматическом сэндвиче для связывания с кэпом. Кроме того, у некоторых аренавирусов Нового Света отсутствует ароматический остаток в области, соответствующей F2042 в LASV L [13].С другой стороны, селективный дефект транскрипции, наблюдаемый с мутантами LASV L-белка W1915E, E2041L, E2041K и F2042D (S4 Fig), подтверждает наши предыдущие выводы о том, что C-конец белка L аренавируса каким-то образом участвует в вирусной транскрипции [13] . Согласно выравниванию последовательностей на S3 Фиг., Остатки, участвующие в транскрипции LASV, картируются в различные области обоих доменов 1 и 2 CASV L-Cterm (S5 Фиг.). Возможное объяснение фенотипа с дефектом транскрипции соответствующих мутантов состоит в том, что эти остатки играют роль в структурной целостности С-конца или во взаимодействиях с другими вирусными или клеточными факторами, участвующими в вирусной транскрипции.Таким образом, структура CASV L-Cterm, данные минирепликона LASV, а также анализы связывания кэпа и термического сдвига в совокупности указывают на отсутствие функционального сайта связывания кэпа в этой области.

Явное структурное сходство между вирусом гриппа PB2 и CASV L-Cterm согласуется с филогенетическим родством вируса гриппа и аренавирусов. Функция связывания кэпа могла быть потеряна во время эволюции аренавируса, в то время как домен мог получить или сохранить другие функции в транскрипции вируса [13].Аналогичная ситуация была предложена для вируса Тогото, ортомиксовируса, передаваемого насекомыми. Субъединицы PA и PB2 полимеразы тоготовируса содержат домены, структурно похожие на эндонуклеазные и кэп-связывающие домены полимеразы вируса гриппа, но с аминокислотными заменами в обоих активных сайтах, которые делают их функционально неактивными [32]. Гипотеза о нефункциональном сайте связывания кэпа в CASV будет означать, что механизм захвата кэпа у рептаренавирусов и, возможно, аренавирусов в целом отличается от механизма вируса гриппа.Действительно, существуют значительные различия в инициации транскрипции между обоими вирусными семействами. Вирус гриппа зависит от ядерной РНК-полимеразы II как поставщика кэпированной РНК клетки-хозяина [33]. Поскольку аренавирусы реплицируются в цитоплазме, они, должно быть, приобрели другой источник клеточно-кэпированных РНК. Это может включать клеточные связывающие кэп белки [34], которые могут замещать кэп-связывающий домен в L-белке. Кроме того, более 50% белка аренавируса L не было ни структурно охарактеризовано, ни назначено четкой функции.Таким образом, все еще возможно, что другой сайт связывания кэпа может присутствовать даже в белке L, хотя в соответствующей области белка L буньявируса не обнаружено никакого домена связывания кэпа [28]. NP-аренавирус также был предложен в качестве связывающего кэп белка [35], хотя эта гипотеза не могла быть подтверждена с использованием системы минирепликонов LASV [36], а в кристаллической структуре комплекса NP-РНК предполагаемый сайт связывания с кэпом оказался для быть сайтом связывания РНК [37].

Альтернативная и спекулятивная гипотеза состоит в том, что потенциальный сайт связывания кэпа в CASV может быть способен принимать альтернативные конфигурации; сайт связывания может переключаться между активной и неактивной конформациями.Они могут, например, соответствовать режиму транскрипции и репликации белка L соответственно. Предполагаемый сайт связывания кэпа в CASV L-Cterm, неактивный в отдельности, может активироваться в физиологическом контексте RNP в результате взаимодействий с другими частями белка L, другими вирусными белками, такими как NP или Z [38-40] , клеточные факторы, вирусная РНК и / или РНК клетки-хозяина. Гипотетический вирусный или клеточный партнер может вызывать конформационные изменения, которые облегчают образование функционального сайта связывания кэпа.Связывание вирусной РНК также оказывает значительное влияние на конфигурацию кэп-связывающего и эндонуклеазного доменов в контексте полного полимеразного комплекса вируса гриппа [15, 41]. Более того, индуцированная подгонка неизвестна для связывающих кэп белков: напр., Связывающие кэп боковые цепи eIF4E подвергаются значительной перестройке при связывании лиганда [42].

В заключение мы решили структуры изолированных N- и C-концов белка CASV L. N-конец содержит предположительно активную эндонуклеазу, захватывающую кэп, которая структурно подобна своим гомологам из маммаренавирусов.С-конец демонстрирует структурное сходство с кэп-связывающим белком PB2 вируса гриппа, хотя сайт связывания кэп не является функциональным в изолированном домене. Наши данные дают представление о возможных сценариях инициации транскрипции у аренавирусов. Будущие эксперименты в контексте полноразмерного белка L могут прояснить подробные механизмы.

Методы

Клонирование, экспрессия и очистка С-конца белка L аренавируса

Основываясь на выравнивании С-концевых последовательностей L-протеина аренавируса, мы разработали конструкции для экспрессии L-протеина различной длины для 20 видов аренавирусов, охватывающих полный филогенетический спектр.Все последовательности были клонированы в векторы pOPINF [43] с использованием набора In-Fusion HD EcoDry Cloning Kit (Clontech). Растворимость фрагментов оценивали на установке средней производительности с различными E . Штаммы coli , автоиндукционная среда и мелкомасштабная очистка His-tag, а также экспрессия и очистка, оптимизированные для растворимых белков. CASV L-Cterm и домен 2 были экспрессированы в E . coli штамм BL21 Gold (DE3) (Novagen) при 17 ° C в течение ночи с использованием среды TB и 0.5 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозид для индукции. После гранулирования клетки ресуспендировали в 50 мМ Трис, pH 8,0, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида, 0,4% (об. / Об.) Тритона X-100 и 0,025% (мас. / Об.) Лизоцима, а затем нарушено ультразвуковой обработкой. Белок очищали от растворимой фракции после центрифугирования с помощью Ni-аффинной хроматографии. Буфер, содержащий 50 мМ имидазола, использовали для стадий отмывки, а другой буфер с 500 мМ имидазола для элюирования белка.За аффинной хроматографией следовала эксклюзионная хроматография (Superdex 200, 50 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 2 мМ дитиотреитол) и удаление N-концевой His-метки с помощью GST-меченной 3C протеазы при 4 ° C в течение ночи. Кроме того, белок очищали анионообменной хроматографией (загрузочный буфер: 50 мМ Трис, pH 7,5, 100 мМ NaCl, элюирование солевым градиентом до 1М NaCl) и эксклюзионной хроматографией второго размера (см. Выше). Очищенные белки концентрировали на центрифугах, быстро замораживали в жидком азоте и хранили в аликвотах при –80 ° C.

Клонирование, экспрессия и очистка эндонуклеазы CASV

Основываясь на выравнивании N-концевых последовательностей L-белка аренавируса, мы разработали конструкции L-белка различной длины для эндонуклеазы CASV. Процедуры клонирования, тестирование растворимости и крупномасштабную экспрессию в основном выполняли, как описано для конструкций CASV L-Cterm. После осаждения клетки ресуспендировали в 50 мМ Na-фосфате, pH 6,8, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазоле и полном ингибиторе протеазы, не содержащем EDTA (Roche). E . coli разрушали обработкой ультразвуком, и белок очищали с помощью Ni-аффинной хроматографии из растворимой фракции после центрифугирования. Буфер, содержащий 50 мМ имидазола, использовали для стадий отмывки, и белок элюировали буфером, содержащим 100 мМ Na-фосфат, pH 6,8, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазол. His-tag удаляли инкубацией с GST-меченной 3C протеазой при 4 ° C в течение ночи с одновременным диализом против 20 мМ Tris pH 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 2.5% глицерин. Кроме того, белок очищали с помощью анионообменной хроматографии (элюирование солевым градиентом до 1 М NaCl) и эксклюзионной хроматографии (Superdex 200, 20 мМ Na-фосфат, pH 6,0, 300 мМ NaCl и 5% глицерин). Очищенные белки концентрировали на центрифугах, быстро замораживали в жидком азоте и хранили в аликвотах при –80 ° C.

Производство меченого селенометионином белка

Экспрессию белка проводили в минимальной среде M9 [44] с добавлением 1 мМ MgSO 4 ,0.4% глюкозы, 0,0005% тиамина и 200 мкМ FeSO 4 при 17 ° C в течение ночи. Включение селенометионина было достигнуто путем метаболического ингибирования биосинтеза метионина в E . coli до добавления селенометионина и индукции 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом. Клетки собирали, и меченый белок очищали, как описано, но в присутствии 5 мМ β-меркаптоэтанола для аффинной очистки Ni и 10 мМ дитиотреитола для остальных стадий очистки.

Кристаллизация и определение структуры CASV L-Cterm и домена 2

Белок CASV L-Cterm продуцировали с использованием селено-метионинового мечения. Кристаллы протеина росли при концентрации протеина 12 мг / мл в 37% Jeffamine ED-2001, 2 мМ TCEP и 100 мМ HEPES pH 7,1 в установке для диффузии паров сидячей капли при 20 ° C. Домен 2 L-Cterm кристаллизовался в присутствии 100 мМ трис, pH 7,9, 1,3 М тринатрийцитрата при концентрации белка 10 мг / мл путем диффузии паров из сидячей капли при 20 ° C.Кристаллы мгновенно замораживали в жидком азоте с 30% глицерином в качестве криозащитного агента. Наборы данных для CASV L-Cterm были получены на канале ID29 ESRF, Гренобль, Франция. Данные для кристаллов L-Cterm домена 2 были собраны на каналах P13 и P14 PETRA III на синхротроне Deutsches Elektronen (DESY), Гамбург, Германия. Наборы данных обрабатывались с помощью iMosflm [45]. Фазы для структуры CASV L-Cterm были определены с использованием метода одиночной аномальной дисперсии и PHENIX AutoSol [46], а затем использованы для расчета структуры с новым набором данных из кристаллов с улучшенной дифракцией.Структура домена L-Cterm 2 была решена путем молекулярного замещения структурой CASV L-Cterm с использованием остатков 1794–1894 и PHASER [47]. Обе структуры были уточнены с помощью итерационных циклов ручного построения модели в Coot [48] и вычислительной оптимизации с помощью PHENIX [46]. Визуализация структурных данных была сделана с использованием PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.7 Schrödinger, LLC.) И UCSF Chimera [49]. Электростатические поверхности рассчитывались с использованием PDB2PQR и APBS [50, 51].

Кристаллизация и определение структуры эндонуклеазы CASV

Белок эндонуклеазы CASV продуцировали как нативный белок (Endo , нативный ) и с селено-метиониновой меткой (Endo SeMet ), соответственно.Кристаллы белка нативного белка Endo росли при концентрации белка 10 мг / мл в 20% PEG 200, 2,5% PEG 3000 и 100 мМ MES, pH 5,7, тогда как белок Endo SeMet кристаллизовался в присутствии 2% 2. -пропанол, 8% PEG 4000, 7 мМ MnCl 2 и 100 мМ Na-цитрат, pH 5,4, при концентрации белка 8 мг / мл. Кристаллы были получены на установке диффузии пара из сидящей капли при 6–8 ° C. Кристаллы мгновенно замораживали в жидком азоте с 30% ПЭГ 400 (Endo нативный ) или 20% этиленгликоля (Endo SeMet ) в качестве криозащитных средств.Наборы данных для обоих белков были собраны на линиях передачи P13 и P14 PETRA III в DESY, Гамбург. Наборы данных обрабатывались с помощью iMosflm [45], а структура Endo SeMet была расшифрована методом единичной аномальной дисперсии с использованием PHENIX AutoSol [46]. Нативная структура Endo была решена путем молекулярного замещения структурой Endo SeMet с использованием только цепи A и PHASER [47]. Уточнения, визуализация структур и расчет электростатических потенциалов поверхности выполнялись как для CASV L-Cterm.

Анализ термической стабильности

Термическую стабильность эндонуклеазы CASV измеряли с помощью термофлуоресцентного анализа [52]. Анализ содержал конечную концентрацию белка эндонуклеазы 4,2 мкМ, 100 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, SYPRO-Orange (конечное разведение 1: 1000) и либо 10 мМ ЭДТА, различные концентрации MnCl 2 или нет. другие добавки.

Температурную стабильность белков L-Cterm CASV, L-Cterm LASV и PB2 вируса гриппа тестировали в присутствии и в отсутствие m. 7 GTP, GTP и ATP.Конечная концентрация белка в этих анализах составляла от 4 до 17 мкМ (CASV L-Cterm 5,3 мкМ, L-Cterm deltaC 5,6 мкМ, L-Cterm домен 2 17,0 мкМ, LASV L-Cterm 4,1 мкМ и PB2 10,6 мкМ). Реакции проводили в 100 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl и SYPRO-Orange.

Анализ связывания с колпачком

Белки инкубировали в течение ночи при 4 ° C или в течение 2 часов при 20 ° C в концентрации 50 мкг / мл с m. 7 GTP-агароза или холостая агароза (оба Jena Bioscience), соответственно, в буфере, содержащем 50 мМ Трис, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 10% глицерина и 0,005% Твина 20. Гранулы агарозы тщательно промывали указанным буфером, и к ним добавляли буфер SDS для образцов для последующего анализа SDS-PAGE.

Анализ сдвига радиоактивной электрофоретической подвижности

40-мерный субстрат полиА-РНК продуцировали путем транскрипции in vitro и радиоактивно метили путем кэппирования кэпирующими ферментами (Cellscript) и α 32 P-GTP. Параллельно синтетическая полиА 40-мерная РНК была помечена полинуклеотидкиназой Т4 (New England Biolabs) и γ 32 P-ATP.Затем субстраты РНК очищали на колонке Microspin G25 (GE Healthcare). Реакции, содержащие 5 пмоль белка и 0,4 пмоль общей РНК (фракция радиоактивно меченой РНК была постоянной во всех реакциях и корректировалась для облегчения надлежащего обнаружения), были установлены в присутствии 0,5 Ед / мкл РНКазина (Promega), 20 мМ HEPES, pH 7,3. , 70 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2 , 0,7 мМ дитиотреитола, 15% глицерина и 0,7 мкг / мкл бычьего сывороточного альбумина и инкубировали в течение 45 мин при 20 ° C. Образцы подвергали электрофорезу в нативном геле с использованием гелей 4% полиакриламид, трис-борат-ЭДТА и 0.5-кратный трис-боратный буфер. Температура геля во время электрофореза поддерживалась низкой. Сигналы визуализировали с помощью авторадиографии с люминесцентным экраном с использованием сканера Typhoon (GE Healthcare).

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

Измерения методом малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) были выполнены после эксклюзионной хроматографии в соответствующих буферах, упомянутых в процедурах очистки белка, с различными концентрациями белка (обычно 0,5–5 мг / мл). Данные были собраны на канале SAXS P12 накопительного кольца PETRA III DESY, Гамбург, Германия [53].Используя пиксельный детектор PILATUS 2M на расстоянии до образца 3,1 м и энергии 10 кэВ (λ = 1,24 Å), был покрыт диапазон передачи импульса 0,01 Å –1 –1 (s = 4π sinθ / λ, где 2θ – угол рассеяния). Данные были проанализированы с помощью пакета ATSAS 2.6 [54]. Рассеяние вперед I (0) и радиус инерции Rg были извлечены из приближения Гинье, рассчитанного с помощью функции AutoRG в программе PRIMUS [55]. GNOM [56] предоставил функцию распределения пар частиц P (r), максимальный размер Dmax и объем Porod. Ab initio Реконструкции были созданы с помощью программы DAMMIF [57]. Десять независимых прогонов DAMMIF были наложены SUPCOMB [58] и усреднены с помощью программы DAMAVER [57]. Средний исключенный том был извлечен из окончательного pdb-файла. Структуры были визуализированы с помощью UCSF Chimera.

Дополнительная информация

S1 Рис. Дополнительные данные для экспериментов SAXS.

A) Сравнение экспериментальных кривых рассеяния (серые точки) и теоретических кривых рассеяния для структуры CASV L-Cterm (красная линия).Приведено значение χ2. Теоретическая кривая была рассчитана и согласована с экспериментальными данными с использованием CRYSOL [59]. B) Сравнение экспериментальных кривых рассеяния (серые точки) и теоретических кривых рассеяния для структуры домена 2 CASV L-Cterm (красная линия). Приведено значение χ2. Теоретическая кривая была рассчитана и согласована с экспериментальными данными с использованием CRYSOL. C) График экспериментальных данных по рассеянию для CASV L-Cterm (черный) и мутанта L-Cterm deltaC (красный), измеренных при равных концентрациях.В таблице показана рассчитанная молекулярная масса (MW) по данным SAXS (полученная из объема Porod и среднего исключенного объема модели DAMFILT [57]) в сравнении с фактической MW белков.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s001

(TIF)

S2 Рис. Выравнивание С-концевых последовательностей аренавируса и PB2 вируса гриппа.

Выравнивание было создано путем объединения вручную результатов программ PRALINE, MUSCLE, ClustalOmega и Jpred4 [29–31, 60].Первоначально он включал последовательности L-белка и предсказания вторичной структуры из 46 маммарен- и рептаренавирусов, которые были сокращены до восьми последовательностей для лучшего обзора. После добавления последовательности PB2 вируса гриппа выравнивание дополнительно корректировали вручную. Наконец, выравнивание включает последовательности белков L рептаренавирусов CASV (Uniprot-ID: J7HBG8) и аренавируса Boa NL (ROUTV, M4PUV6) и маммаренавирусов LASV (Q6Y630), вируса Mobala (MOBV, Q27YE5), LCMV, вируса Junin (P14240). JUNV, Q6XQI4), вирус Tacaribe (TACV, P20430) и вирус Oliveros (OLVV, Q6XQH7), а также последовательность PB2 вируса гриппа A (FluA, Q6DNN3).N- и C-концы домена 2 CASV L-Cterm отмечены красными треугольниками. Потенциальные кэп-связывающие ароматические остатки CASV отмечены оранжевой звездочкой. Консервативный C-концевой хвост аренавирусов выделен желтым прямоугольником. Вторичная структура кристаллической структуры CASV L-Cterm (CASV Xtal) показана над последовательностями. Вторичные структуры, предсказанные Jpred4, показаны под последовательностями. Вторичная структура кристаллической структуры PB2 вируса гриппа (FluA Xtal, PDB ID 5FMM) показана внизу.Выравнивание было проведено с помощью онлайн-инструмента ESPript (http://espript.ibcp.fr) [61] с ручной настройкой.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s002

(TIF)

S3 Рис. Остатки в белке L LASV, функционально протестированные в системе минирепликонов LASV, выровнены с их предполагаемыми гомологами в других аренавирусах.

Выравнивание идентично выравниванию, представленному на фиг. S2. Остатки в белке L LASV, которые были мутированы и протестированы в системе минирепликонов LASV (методы S1), помечены вместе с их предполагаемыми гомологами в других аренавирусах.Остатки, идентифицированные как важные для транскрипции LASV в этом и предыдущем исследовании [13], выделены оранжевым, в то время как остатки, не играющие специфической роли во время вирусной транскрипции, отмечены серым.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s003

(TIF)

S4 Рис. Данные минирепликонов для мутантов белка LASV L.

Транскрипционную активность мутантов L-белка измеряли с помощью экспрессии репортерного гена Ren-Luc. Активность Ren-Luc показана на гистограмме (среднее и стандартное отклонение стандартизованных относительных световых единиц [sRLU] в процентах от дикого типа в ≥3 независимых экспериментах по трансфекции).Синтез антигенома и мРНК Ren-Luc оценивали методом Нозерн-блоттинга с использованием радиоактивно меченного рибозонда, гибридизующегося с геном Ren-Luc. Дефектный белок L с мутацией в каталитическом сайте РНК-зависимой РНК-полимеразы служил отрицательным контролем (нег). Сигналы на Нозерн-блоттинге количественно оценивали с помощью профилей интенсивности. Данные также представлены в числовом виде в таблице S2. Окрашенная метиленовым синим 28S рРНК показана как маркер для загрузки геля и переноса РНК. Показан иммуноблот-анализ мутантов белка L с меткой FLAG.Мутанты с фенотипом с дефектом мРНК отмечены звездочкой. Подробные сведения об эксперименте см. В разделе “Методы S1”.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s004

(TIF)

S5 Рис. Связывание данных репликона LASV со структурой L-Cterm CASV.

Схема ленты конструкции CASV L-Cterm в A) Мушка и B) Мушка . Остатки, которые, как было установлено, важны для вирусной транскрипции в системе минирепликонов LASV в этом и предыдущем исследовании [13] и могут быть локализованы в структуре L-Cterm CASV в соответствии с выравниванием на S3 Fig, показаны как красные палочки. C) Сводка остатков, важных для транскрипции LASV. В таблице далее перечислены предполагаемые эквивалентные остатки в CASV, их расположение в домене 1 или 2 CASV L-Cterm и предложена функция этих остатков в структуре CASV L-Cterm.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s005

(TIF)

S6 Рис. Анализы связывания крышки.

A) Анализ связывания с m 7 GTP-агарозой. На рисунке показаны гели SDS, окрашенные кумасси, включая маркер молекулярной массы (MW).Для каждого протестированного белка гель содержит три дорожки: белок, который будет использоваться для анализа (первая дорожка), фракция, связанная с m 7 GTP-агарозой (вторая дорожка, m 7 GTP), и фракция, связанная с холостым сигналом. агароза в качестве контроля специфичности (третья полоса, контроль). eIF4E и вирус гриппа PB2 использовали в качестве положительного контроля для связывания m 7 GTP-агарозы. CASV L-Cterm (Cterm), L-Cterm домен 2 (домен 2), L-Cterm deltaC (deltaC) и LASV L-Cterm были протестированы при 4 ° C и 20 ° C. B) Анализ связывания с кэпированной РНК. Радиоактивно меченая кэпированная РНК инкубировали либо с вирусом гриппа PB2 (PB2), либо с CASV L-Cterm (Cterm), CASV L-Cterm deltaC (deltaC), доменом 2 CASV L-Cterm (домен 2), L-Cterm LASV (LASV C). или без белка (нег). Свободную РНК и комплексы белок-РНК разделяли в нативном геле и визуализировали с помощью авторадиографии. C) Анализ для проверки связывания РНК независимо от кэп-структуры для CASV L-Cterm deltaC. CASV L-Cterm deltaC (deltaC) инкубировали с различными количествами кэпированной (кэп-РНК) или не кэпированной РНК (РНК) в присутствии радиоактивно меченой некэпированной РНК ( 32 P-РНК).Общее количество РНК оставалось постоянным во всех реакциях. Свободную РНК и комплексы белок-РНК разделяли в нативном геле и визуализировали с помощью авторадиографии.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s006

(TIF)

S7 Рис. Анализ термостабильности в присутствии m

7 GTP, GTP или ATP.

Температурную стабильность белков CASV L-Cterm, CASV L-Cterm deltaC, домена 2 CASV L-Cterm, PB2 вируса гриппа и L-Cterm LASV измеряли в отсутствие (контроль) и в присутствии 2, 5 и 10 мМ. либо m 7 GTP, GTP или ATP.Представленные кривые показывают относительное увеличение сигнала флуоресценции (связанного с разворачиванием белка) в зависимости от температуры. Разница не менее 3 ° C при уровне флуоресценции 50% (пунктирная линия серого цвета) указывает на значительное изменение термостабильности белка.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s007

(TIF)

S8 Рис. Выравнивание N-концевых последовательностей аренавируса и PA гриппа.

Выравнивание было произведено с помощью ClustalOmega [31] с ручной настройкой.Он включает последовательности белков L рептаренавирусов CASV (Uniprot-ID: J7HBG8) и аренавируса удавов NL (ROUTV, M4PUV6) и маммаренавирусов LASV (Q6Y630), вируса Mobala (MOBV, Q27YE5), LCMV (P14240), вируса Junin (JUNin). Q6XQI4), вируса Tacaribe (TACV, P20430) и вируса Oliveros (OLVV, Q6XQH7), а также последовательности PA вируса гриппа A (FluA, P31343). Ключевые остатки активного сайта эндонуклеазы отмечены красными треугольниками. Вторичная структура кристаллической структуры эндонуклеазы CASV (CASV Xtal) показана над последовательностями.Вторичные структуры, предсказанные Jpred4 [60], показаны под последовательностями. Вторичная структура кристаллической структуры PA вируса гриппа (FluA Xtal, PDB ID 2W69) показана внизу. Выравнивание было проведено с помощью онлайн-инструмента ESPript (http://espript.ibcp.fr) [61] с ручной настройкой.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s008

(TIF)

S9 Рис. Эндонуклеазный анализ для CASV Endo.

Активность эндонуклеазы CASV была протестирована в нашем ранее опубликованном анализе радиоактивных эндонуклеаз (методы S1) [17]. 32 P-меченные субстраты оцРНК полиА двух различных длин (27 и 40 нуклеотидов) инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C либо в присутствии, либо в отсутствие 5 мМ Mn 2+ с каталитически активной мутантной эндонуклеазой вируса Анд ( ANDV Endo K44A ), каталитически неактивный мутант эндонуклеазы Андского вируса (ANDV Endo h46R ) или фрагмент эндонуклеазы CASV (CASV Endo). Субстраты и продукты реакции разделяли в денатурирующем полиакриламидном геле и визуализировали с помощью авторадиографии.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s009

(TIF)

S10 Рис. Электростатический поверхностный потенциал CASV L-Cterm.

Участки кислотных и основных аминокислот от С-конца, которые сцепляются друг с другом в димере белка, отмечены пунктирными кружками. Электростатический поверхностный потенциал показан от -5 кТ / э красным цветом до +5 кТ / э синим и был рассчитан с использованием PDB2PQR и APBS-инструмента PyMOL.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s010

(TIF)

S13 Рис. Выравнивание N-концевых последовательностей рептаренавируса.

Выравнивание было произведено с использованием ClustalOmega [31] и включает последовательности из L белков рептаренавирусов CASV (Uniprot-ID: J7HBG8), аренавируса Boa NL (ROUTV, M4PUV6), а также 13 последовательностей других белков L рептаренавируса (Uniprot-ID). данный). Вторичная структура кристаллической структуры эндонуклеазы CASV (CASV Xtal) показана над последовательностями. Выравнивание было проведено с помощью онлайн-инструмента ESPript (http: // espript.ibcp.fr) [61].

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s013

(TIF)

S14 Рис. Выравнивание С-концевых последовательностей рептаренавируса.

Выравнивание было произведено с использованием ClustalOmega [31] и включает последовательности из L белков рептаренавирусов CASV (Uniprot-ID: J7HBG8), аренавируса Boa NL (ROUTV, M4PUV6), а также 13 последовательностей других белков L рептаренавируса (Uniprot-ID). данный). Вторичная структура кристаллической структуры CASV L-Cterm (CASV Xtal) показана над последовательностями.Выравнивание было проведено с помощью онлайн-инструмента ESPript (http://espript.ibcp.fr) [61] с ручной настройкой.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006400.s014

(TIF)

Благодарности

Мы благодарим Каролу Буш, Стефани Вурр и Коре Шлоттау за отличную техническую помощь. Мы благодарим Грегора Витте, Томаса Шнайдера, Маркуса Пербандта и сотрудников компании PETRA III (P13, P14, P12), SLS (PX II) и ESRF (ID29) за их поддержку. Мы также благодарим Colin McVey и Micael Freitas за плазмиду экспрессии 3C-протеазы и протокол очистки.Благодарим программы ЕС P-CUBE и Biostruct-X за поддержку предварительных исследований. Мы благодарим Yaiza Fernández García за экспериментальную поддержку и плодотворные обсуждения и Lisa Oestereich за плодотворные обсуждения.

Вклад авторов

  1. Концептуализация: MR SG SR.
  2. Финансирование: SG SR.
  3. Расследование: MR NG DV JR BR SR.
  4. Администрация проекта: MR SR.
  5. Написание – первоначальный эскиз: MR SC SG SR.

Ссылки

  1. 1. Радошицкий С.Р., Бао Ю., Бухмайер М.Дж., Чаррел Р.Н., Клоусон А.Н., Клегг С.С. и др. Прошлое, настоящее и будущее таксономии аренавирусов. Arch Virol. 2015; 160 (7): 1851–74. pmid: 25935216
  2. 2. Гюнтер С., Вирус Ленца О. Ласса. Критические обзоры в клинических лабораторных науках. 2004. 41 (4): 339–90. pmid: 15487592
  3. 3. Hass M, Golnitz U, Muller S, Becker-Ziaja B, Gunther S. Replicon system для вируса Ласса.Журнал вирусологии. 2004. 78 (24): 13793–803. pmid: 15564487
  4. 4. Раджу Р., Раджу Л., Хакер Д., Гарсин Д., Компанс Р., Колакофски Д. Не предполагаемые основания на 5′-концах мРНК вируса Такарибе. Вирусология. 1990. 174 (1): 53–9. pmid: 2294647
  5. 5. Морин Б., Кутар Б., Лельке М., Феррон Ф., Кербер Р., Джамал С. и др. N-концевой домен белка L аренавируса является эндонуклеазой РНК, необходимой для транскрипции мРНК. PLoS Pathog. 2010; 6 (9): e1001038. pmid: 20862324
  6. 6.Поляк С.Ю., Чжэн С., Харниш Д.Г. 5′-концы S-РНК и мРНК аренавируса Pichinde содержат не предполагаемые нуклеотиды. J Virol. 1995. 69 (5): 3211–5. pmid: 7707553
  7. 7. Мейер Б.Дж., Южная Пижама. Анализ параллельных последовательностей 5 ‘и 3’ концов РНК с помощью внутримолекулярной циркуляризации выявляет 5 ‘нетемпинговые основания и 3’ концевую гетерогенность мРНК вируса лимфоцитарного хориоменингита. J Virol. 1993. 67 (5): 2621–7. pmid: 7682625
  8. 8. Plotch SJ, Bouloy M, Ulmanen I, Krug RM.Уникальная кэп (m7GpppXm) -зависимая эндонуклеаза вириона гриппа расщепляет кэпированные РНК с образованием праймеров, которые инициируют транскрипцию вирусной РНК. Клетка. 1981; 23 (3): 847–58. pmid: 6261960
  9. 9. Guilligay D, Tarendeau F, Resa-Infante P, Coloma R, Crepin T, Sehr P и др. Структурная основа связывания кэпа субъединицей полимеразы вируса гриппа PB2. Nat Struct Mol Biol. 2008. 15 (5): 500–6. pmid: 18454157
  10. 10. Dias A, Bouvier D, Crepin T, McCarthy AA, Hart DJ, Baudin F, et al.Эндонуклеаза полимеразы вируса гриппа, захватывающая кепку, находится в субъединице PA. Природа. 2009. 458 (7240): 914–8. pmid: 19194459
  11. 11. Юань П., Бартлам М., Лу З., Чен С., Чжоу Дж., Хе Х и др. Кристаллическая структура полимеразы птичьего гриппа PA (N) выявляет активный сайт эндонуклеазы. Природа. 2009. 458 (7240): 909–13. pmid: 19194458
  12. 12. Регуэра Дж., Вебер Ф., Кьюсак С. РНК-полимеразы Bunyaviridae (L-белок) имеют N-концевой, гриппоподобный эндонуклеазный домен, необходимый для вирусной кэп-зависимой транскрипции.PLoS Pathog. 2010; 6 (9): e1001101. pmid: 20862319
  13. 13. Леманн М., Палманн М., Джером Х., Буш С., Лелке М., Гюнтер С. Роль С-конца белка L вируса Ласса в синтезе вирусной мРНК. J Virol. 2014. 88 (15): 8713–7. pmid: 24829349
  14. 14. Холм Л., Розенстрем П. Сервер Дали: сохранение карт в 3D. Nucleic Acids Res. 2010; 38 (выпуск веб-сервера): W545–9. pmid: 20457744
  15. 15. Thierry E, Guilligay D, Kosinski J, Bock T., Gaudon S, Round A и др.Полимераза гриппа может принять альтернативную конфигурацию, включающую радикальную переупаковку доменов PB2. Mol Cell. 2016; 61 (1): 125–37. pmid: 26711008
  16. 16. Wallat GD, Huang Q, Wang W, Dong H, Ly H, Liang Y, et al. Структура высокого разрешения N-концевого эндонуклеазного домена L-полимеразы вируса ласса в комплексе с ионами магния. PLoS One. 2014; 9 (2): e87577. pmid: 24516554
  17. 17. Фернандес-Гарсия Y, Регера Дж., Буш С., Витте Дж., Санчес-Рамос О, Бетцель С. и др.Атомная структура и биохимическая характеристика РНК-эндонуклеазы на N-конце белка L вируса Анд. PLoS Pathog. 2016; 12 (6): e1005635. pmid: 27300328
  18. 18. Reich S, Guilligay D, Pflug A, Malet H, Berger I, Crepin T и др. Структурное понимание захвата крышки и синтеза РНК полимеразой гриппа. Природа. 2014. 516 (7531): 361–6. pmid: 25409151
  19. 19. Паттерсон Дж. Л., Колакофски Д. Характеристика транскриптов малого генома вируса Ла Кросса.J Virol. 1984. 49 (3): 680–5. pmid: 6321757
  20. 20. Эшита Ю., Эриксон Б., Романовский В., Епископ Д.Х. Анализ процессов транскрипции мРНК S- и M-видов РНК буньявируса зайца-снегоступа. J Virol. 1985. 55 (3): 681–9. pmid: 4020962
  21. 21. Ихара Т., Мацуура Ю., Епископ Д.Х. Анализ процессов транскрипции мРНК флебовируса Punta Toro (Bunyaviridae). Вирусология. 1985. 147 (2): 317–25. pmid: 2416115
  22. 22. Джин Х., Эллиотт Р.М. Невирусные последовательности на 5′-концах мРНК S.J Gen Virol. 1993. 74 (Pt 10): 2293–7.
  23. 23. Kormelink R, van Poelwijk F, Peters D, Goldbach R. Невирусные гетерогенные последовательности на 5′-концах мРНК вируса пятнистого увядания томатов. J Gen Virol. 1992. 73 (Pt 8): 2125–8.
  24. 24. Саймонс Дж. Ф., Петтерссон РФ. Производные от хозяина 5′-концы и перекрывающиеся комплементарные 3′-концы двух мРНК, транскрибируемых из амбисмыслового S-сегмента вируса Уукуниеми. J Virol. 1991. 65 (9): 4741–8. pmid: 1831239
  25. 25. Лелке М., Брунотт Л., Буш С., Гюнтер С.N-концевая область белка L вируса Ласса играет важную роль в транскрипции, но не в репликации вирусного генома. Журнал вирусологии. 2010. 84 (4): 1934–44. pmid: 20007273
  26. 26. Регера Дж., Герлах П., Розенталь М., Годон С., Кошиа Ф., Гюнтер С. и др. Сравнительный структурный и функциональный анализ эндонуклеаз буньявируса и аренавируса, захватывающих кепку. PLoS Pathog. 2016; 12 (6): e1005636. pmid: 27304209
  27. 27. Фехтер П., Браунли Г.Г. Распознавание кэп-структур мРНК вирусными и клеточными белками.J Gen Virol. 2005; 86 (Pt 5): 1239–49. pmid: 15831934
  28. 28. Герлах П., Малет Х., Кьюсак С., Регера Дж. Структурные представления о репликации буниавируса и ее регуляции промотором вРНК. Клетка. 2015; 161 (6): 1267–79. pmid: 26004069
  29. 29. Simossis VA, Heringa J. PRALINE: набор инструментов для множественного выравнивания последовательностей, который объединяет информацию о расширенной гомологии и вторичной структуре. Исследования нуклеиновых кислот. 2005; 33 (выпуск веб-сервера): W289–94. pmid: 15980472
  30. 30.Эдгар RC. МЫШЦЫ: множественное выравнивание последовательностей с высокой точностью и высокой пропускной способностью. Nucleic Acids Res. 2004. 32 (5): 1792–7. pmid: 15034147
  31. 31. McWilliam H, Li W, Uludag M, Squizzato S, Park YM, Buso N и др. Веб-службы инструментов анализа из EMBL-EBI. Nucleic Acids Res. 2013; 41 (выпуск веб-сервера): W597–600. pmid: 23671338
  32. 32. Guilligay D, Kadlec J, Crepin T, Lunardi T, Bouvier D, Kochs G, et al. Сравнительный структурный и функциональный анализ кэп-захватывающих доменов ортомиксовирусной полимеразы.PLoS One. 2014; 9 (1): e84973. pmid: 24454773
  33. 33. Маккракен С., Фонг Н., Розонина Е., Янкулов К., Братья Г., Сидеровски Д. и др. Ферменты 5′-кэппинга нацелены на пре-мРНК путем связывания с фосфорилированным карбокси-концевым доменом РНК-полимеразы II. Genes Dev. 1997. 11 (24): 3306–18. pmid: 9407024
  34. 34. Фридрыскова К., Масек Т., Борчин К., Мрвова С., Вентури В., Поспишек М. Отчетливое привлечение изоформ eIF4E человека к процессирующим телам и стрессовым гранулам.BMC Mol Biol. 2016; 17 (1): 21. pmid: 27578149
  35. 35. Qi X, Lan S, Wang W, Schelde LM, Dong H, Wallat GD и др. Связывание кэпа и уклонение от иммунитета, выявленное структурой нуклеопротеина Ласса. Природа. 2010. 468 (7325): 779–83. pmid: 21085117
  36. 36. Брунотт Л., Кербер Р., Шан В., Хауэр Ф., Хасс М., Габриэль М. и др. Структура нуклеопротеина вируса Ласса, выявленная методами рентгеновской кристаллографии, малоуглового рентгеновского рассеяния и электронной микроскопии. ЖУРНАЛ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ.2011. 286 (44): 38748–56. pmid: 21

    9
  37. 37. Хасти К.М., Лю Т., Ли С., Кинг Л. Б., Нго Н., Зандонатти М. А. и др. Кристаллическая структура комплекса нуклеопротеин-РНК вируса Ласса выявляет стробирующий механизм для связывания РНК. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2011; 108 (48): 19365–70. pmid: 22084115
  38. 38. Jacamo R, Lopez N, Wilda M, Franze-Fernandez MT. Белок Z вируса такарибе взаимодействует с белком L-полимеразы, подавляя синтез вирусной РНК. J Virol. 2003. 77 (19): 10383–93.pmid: 12970423
  39. 39. Ивасаки М., Нго Н., Кубитт Б., де ла Торре Дж. Эффективное взаимодействие между аренавирусным нуклеопротеином (NP) и РНК-зависимой РНК-полимеразой (L) опосредуется матрицей вирусного нуклеокапсида (NP-РНК). J Virol. 2015; 89 (10): 5734–8. pmid: 25762740
  40. 40. Кербер Р., Ригер Т., Буш С., Флатц Л., Пинчевер Д.Д., Куммерер Б.М. и др. Межвидовой анализ репликационного комплекса аренавирусов Старого Света выявил два нуклеопротеиновых сайта, участвующих в функции L-белка.J Virol. 2011. 85 (23): 12518–28. pmid: 21

    2
  41. 41. Хенгрунг Н., Эль-Омари К., Серна Мартин I, Фрид Ф. Т., Кьюсак С., Рэмбо Р. П. и др. Кристаллическая структура РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гриппа С. Природа. 2015; 527 (7576): 114–7. pmid: 26503046
  42. 42. Волпон Л., Осборн М.Дж., Тописирович И., Сиддики Н., Борден К.Л. Свободная от кэпа структура eIF4E предполагает основу для конформационной регуляции его лигандами. EMBO J. 2006; 25 (21): 5138–49. pmid: 17036047
  43. 43.Берроу Ник С., доктор медицины, Сейнсбери Сара, Неттлшип Джоанн, Ассенберг Рене Р. Н., Стюарт Дэвид И. и Оуэнс Реймонд Дж. Универсальный независимый от лигирования метод клонирования, подходящий для приложений высокопроизводительного скрининга экспрессии. Исследования нуклеиновых кислот. 2007.
  44. 44. Эльбинг К.Л., Брент Р. Подготовка сред и бактериологические инструменты. Curr Protoc Protein Sci. 2001; Приложение 4: Приложение 4A.
  45. 45. Бэтти Т.Г., Контогианнис Л., Джонсон О., Пауэлл Х.Р., Лесли А.Г.iMOSFLM: новый графический интерфейс для обработки дифракционных изображений с помощью MOSFLM. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2011; 67 (Pt 4): 271–81. pmid: 21460445
  46. 46. Адамс П.Д., Афонин П.В., Бункочи Г., Чен В.Б., Дэвис И.В., Эчолс Н. и др. PHENIX: комплексная система на основе Python для решения макромолекулярных структур. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010; 66 (Pt 2): 213–21. pmid: 20124702
  47. 47. Маккой AJ, Grosse-Kunstleve RW, Adams PD, Winn MD, Storoni LC, Read RJ.Кристаллографическое программное обеспечение Phaser. J Appl Crystallogr. 2007; 40 (Pt 4): 658–74. pmid: 19461840
  48. 48. Эмсли П., Локамп Б., Скотт В.Г., Каутан К. Особенности и развитие Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2010; 66 (Pt 4): 486–501. pmid: 20383002
  49. 49. Петтерсен Э.Ф., Годдард Т.Д., Хуанг С.К., Коуч Г.С., Гринблатт Д.М., Мэн Э.С. и др. UCSF Chimera – система визуализации для поисковых исследований и анализа. J. Comput Chem. 2004. 25 (13): 1605–12. pmid: 15264254
  50. 50.Долинский TJ, Czodrowski P, Li H, Nielsen JE, Jensen JH, Klebe G, et al. PDB2PQR: расширение и обновление автоматизированной подготовки биомолекулярных структур для молекулярного моделирования. Nucleic Acids Res. 2007; 35 (выпуск веб-сервера): W522–5. pmid: 17488841
  51. 51. Бейкер Н. А., сентябрь D, Джозеф С., Холст М. Дж., Маккаммон Дж. А.. Электростатика наносистем: приложение к микротрубочкам и рибосоме. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2001; 98 (18): 10037–41. pmid: 11517324
  52. 52. Максвелл Д.Каммингс МАФАМИН. Универсальные методы скрининга и применение ThermoFluor. Экран J Biomol. 2006.
  53. 53. Blanchet CE, Spilotros A, Schwemmer F, Graewert MA, Kikhney A, Jeffries CM и др. Универсальные среды для образцов и автоматизация экспериментов по рассеянию рентгеновских лучей в биологических растворах на канале P12 (PETRA III, DESY). J Appl Crystallogr. 2015; 48 (Pt 2): 431–43. pmid: 25844078
  54. 54. Петухов М.В., Франке Д., Шкуматов А.В., Триа Г., Кихней А.Г., Гайда М. и др.Новые разработки в программном пакете ATSAS для анализа данных малоуглового рассеяния. J Appl Crystallogr. 2012; 45 (Pt 2): 342–50. pmid: 25484842
  55. 55. Конарев П.В., Волков В.В., Соколова А.В., Кох MHJ, Свергун Д.И. ПРИМУС: система на базе ПК с ОС Windows для анализа данных малоуглового рассеяния. Журнал прикладной кристаллографии. 2003; 36: 1277–82.
  56. 56. Свергун Д. Определение параметра регуляризации в методах непрямого преобразования с использованием критериев восприятия.J Appl Cryst. 1992 (25): 495–503.
  57. 57. Волков В., Свергун Д. Уникальность ab initio определения формы при малоугловом рассеянии. J Appl Cryst. 2003.
  58. 58. Козин М., Свергун Д. Автоматическое сопоставление структурных моделей высокого и низкого разрешения. J Appl Cryst. 2001.
  59. 59. Свергун Д.И., Барберато С., Кох MHJ. CRYSOL – программа для оценки рассеяния биологических макромолекул в растворе рентгеновских лучей по атомным координатам. J Appl Cryst. 1995; 28: 768–73.
  60. 60. Дроздецкий А., Коул С., Проктер Дж., Бартон Дж. Дж. JPred4: сервер прогнозирования вторичной структуры белка. Nucleic Acids Res. 2015; 43 (W1): W389–94. pmid: 25883141
  61. 61. Роберт X, Гуэ П. Расшифровка ключевых особенностей белковых структур с новым сервером ENDscript. Nucleic Acids Res. 2014; 42 (выпуск веб-сервера): W320–4. pmid: 24753421

Структурные сведения о механизмах взятия колпачков у рептаренавируса

Реферат

Отрывание колпачков было впервые обнаружено у вируса гриппа.Структуры вовлеченных доменов полимеразы вируса гриппа, а именно эндонуклеазы в субъединице PA и кэп-связывающего домена в субъединице PB2, были решены. Эндонуклеазы, захватывающие кэп, также были продемонстрированы на самом N-конце L белков маммарены, ортобунии и хантавирусов. Однако до сих пор не идентифицирован кэп-связывающий домен в белке L арены или буньявируса. Мы решили структуру 326 C-концевых остатков L-белка вируса Калифорнийской академии наук (CASV), рептаренавируса, с помощью рентгеновской кристаллографии.Отдельные домены этого 37-кДа фрагмента (L-Cterm), а также расположение доменов структурно сходны с кэп-связывающими и соседними доменами субъединицы полимеразы вируса гриппа PB2, несмотря на отсутствие гомологии последовательностей, что предполагает общее эволюционное происхождение. . Это позволило идентифицировать область в CASV L-Cterm, сходную с сайтом связывания кэпа; однако типичный бутерброд из двух ароматических остатков отсутствовал. В соответствии с этим связывание кэпа с CASV L-Cterm не может быть обнаружено биохимически.Кроме того, мы решили кристаллическую структуру соответствующей эндонуклеазы на N-конце белка L CASV. Он показывает типичную эндонуклеазную складку с конфигурацией активного сайта, которая по существу идентична структуре известных эндонуклеазных структур маммаренавируса. В заключение мы приводим доказательства предположительно функциональной эндонуклеазы, захватывающей кэп, на N-конце и вырожденного домена, связывающего кэп, на С-конце белка L рептаренавируса. Обсуждаются последствия этих открытий для механизма захвата крышек у аренавирусов.

Об авторе

Аренавирусы встречаются во всем мире и могут вызывать тяжелую, часто смертельную геморрагическую лихорадку у людей. Вакцины и эффективные методы лечения отсутствуют. Аренавирусы реплицируются в цитоплазме инфицированных клеток, и, поскольку они не могут синтезировать кэп-структуры, они используют механизм, называемый захватом кэпов, для похищения кэп-структур с мРНК хозяина для транскрипции вируса. Этот механизм является привлекательной мишенью для лекарств, поскольку он важен для репликации вируса и специфичен для вируса.Однако аренавирусные компоненты этого механизма плохо определены по сравнению с вирусом гриппа, прототипическим вирусом, снимающим колпачок. Мы представляем первые кристаллические структуры двух предполагаемых компонентов механизма захвата аренавирусов Калифорнийской академии наук, а именно изолированные N- и C-концы вирусной РНК-полимеразы (L-белок). На N-конце находится то, что выглядит как функциональная эндонуклеаза, захватывающая кэп. С-конец L-белка, несмотря на полное расхождение последовательностей, демонстрирует общее структурное сходство с С-концевым участком субъединицы полимеразы вируса гриппа PB2, что указывает на общее эволюционное происхождение.Присутствует домен, явно связанный с доменом связывания кэпа PB2, хотя связывание кэпа не может быть продемонстрировано биохимически. Определенные структуры обеспечивают основу для будущих исследований, направленных на раскрытие деталей механизма захвата крышек аренавируса и его потенциала в качестве мишени для разработки лекарств.

Введение

Семейство аренавирусов делится на два рода: маммаренавирусы и рептаренавирусы. За исключением вируса Такарибе, грызуны считаются естественными резервуарами маммаренавирусов.Рептаренавирусы были обнаружены только у содержащихся в неволе змей [1]. Некоторые аренавирусы, такие как вирус Ласса (LASV), вирус Хунина и вирус Мачупо, могут вызывать тяжелые заболевания человека с геморрагическими и неврологическими симптомами. На сегодняшний день единственным лекарством, доступным для лечения аренавирусных инфекций, является рибавирин, который предположительно нацелен на вирусную репликацию [2].

Аренавирусы представляют собой частицы с оболочкой, которые содержат два одноцепочечных сегмента отрицательной смысловой РНК. Два сегмента генома кодируют четыре вирусных белка, нуклеопротеин (NP), гликопротеин-предшественник, малый матричный белок Z и большой белок L> 200 кДа, который содержит вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразу.Минимальными вирусными компонентами для репликации и транскрипции генома являются вирусная РНК, NP и белок L [3]. Белок L синтезирует два различных вида РНК: (i) антигеномную и геномную РНК как продукты репликации генома и (ii) более короткие кэпированные вирусные мРНК во время транскрипции. Предположительно, чтобы инициировать вирусную транскрипцию, белок L использует процесс, называемый захватом крышки. Предполагается, что белок L расщепляет мРНК клетки-хозяина ниже 5′-кэп-структуры и использует эту короткую кэпированную РНК в качестве праймера для синтеза вирусной мРНК.В соответствии с этой гипотезой 4–5 нетемплатированных нуклеотидов обнаруживаются на 5′-концах вирусных мРНК, а в N-концевой области L-белка присутствует эндонуклеаза [4–7]. Прототипом вирусов, захватывающих кэп, является вирус гриппа [8], который содержит эндонуклеазу в субъединице PA вирусной полимеразы, а также сайт связывания кэпа в субъединице PB2 [9–11]. Учитывая филогенетическое родство и сходство в цикле репликации ортомиксовирусов и аренавирусов – оба являются сегментированными вирусами с РНК с отрицательной цепью – разумно предположить, что белок L аренавируса также имеет сайт связывания кэпа, хотя прямых доказательств этого нет. [12].Предыдущие функциональные данные, полученные с помощью репликонной системы LASV, позволили предположить, что сайт связывания кэпа может располагаться на С-конце белка L [13].

Чтобы дополнительно охарактеризовать механизм захвата крышки у аренавирусов, мы попытались решить структуру N- и C-концевых доменов L белков различных аренавирусов. В конце концов, мы добились успеха с L-белком вируса Калифорнийской академии наук (CASV), который является рептаренавирусом. Здесь мы представляем кристаллические структуры двух концевых доменов белка L CASV: эндонуклеазы, захватывающей кэп, на N-конце и 326 C-концевых остатков, которые, по аналогии с LASV, могут играть роль в транскрипции [13 ].Активный сайт эндонуклеазы почти идентичен другим родственным ферментам, что позволяет предположить, что рептаренавирусы используют механизм захвата кэпа для синтеза мРНК. С-концевой домен структурно связан с белком PB2 вируса гриппа и имеет предполагаемый нефункциональный сайт связывания кэпа. Мы размышляем о его роли в механизме захвата кепки аренавирусов и обсуждаем наши данные в контексте доступных структурных и функциональных данных из других сегментированных вирусов с отрицательной цепью РНК.

Результаты

Дизайн конструкции и скрининг растворимости C-концевых фрагментов L-белка аренавируса

Для получения растворимых белковых фрагментов C-концевого домена мы клонировали и протестировали более 120 различных фрагментов L-белка из 20 видов аренавирусов, охватывающих широкий филогенетический спектр растворимой экспрессии в Escherichia coli (см. таблицу S3). Первоначально пятнадцать процентов белков были растворимы. Растворимые кандидаты очищали аффинной никелевой хроматографией и эксклюзионной хроматографией и тестировали на стабильность.Около пяти процентов фрагментов были монодисперсными и стабильными и использовались для испытаний по кристаллизации. Оптимизация экспрессируемых фрагментов с использованием биоинформатики, ограниченного протеолиза и анализов термостабильности привела к C-концевым 326 аминокислотам белка L CASV (остатки 1721-2046; нумерация остатков относится к полноразмерному белку L) с N-концевым His -тэг как лучший кандидат для определения структуры.

Структура C-конца белка L CASV

После расщепления His-tag очищенный селен-метионин-меченый белок был успешно кристаллизован, и его структура была решена с использованием метода единичной аномальной дисперсии.Белок (названный CASV L-Cterm) кристаллизовался в пространственной группе P2 1 2 1 2 1 с двумя молекулами на асимметричную единицу, и структура могла быть уточнена до разрешения 2 Å (, таблица S1). За исключением остатков 1748, 1762 и 1768 в цепи A и области, содержащей остатки 2034-2040 в цепи B, для структуры наблюдалась чистая электронная плотность. Белок кристаллизовался в виде димера, который не является полностью симметричным. Единственное заметное различие между мономерами заключается в гибких петлях, соединяющих два описанных ниже домена.Эта димерная форма также наблюдается в растворе, как было выявлено с помощью эксклюзионной хроматографии и измерений SAXS (, S1A фиг.). Белковый мономер имеет U-образную форму и состоит из двух отдельных доменов: (i) преимущественно α-спирального домена (домен 1), состоящего из остатков 1721–1793 и 1894–2046 с длинным C-концевым хвостом, и (ii) домена (домен 2), состоящий из большого β-листа, а также одной длинной и двух коротких α-спиралей (остатки 1794–1894) (соответственно, синий и зеленый). Второй домен вставлен в последовательность первого, и оба домена соединены двумя длинными гибкими линкерами без каких-либо дополнительных контактов.

Атомная структура CASV L-Cterm.

A) Структура димера белка в асимметричной единице показана в виде ленточной диаграммы спереди и сбоку. Цепочка A окрашена в синий и зеленый цвета, цепочка B – в темно-серый и светло-серый цвета. Помечены N- и C-концы. B) Цепь A показана в виде ленточной диаграммы. Помечены N- и C-концы. Домен 1 показан синим цветом, домен 2 – зеленым. C) Наложение формы молекулы, полученной из SAXS, на кристаллическую структуру (ленточная диаграмма) подтверждает димерную конформацию белка при концентрации 1 мг / мл в растворе.

В кристаллизованном димере два U-образных мономера сцепляются друг с другом, образуя кольцо с отверстием в середине с площадью скрытой поверхности приблизительно 3000 Å. 2 между мономерами. Наиболее интенсивные межмолекулярные контакты происходят между 40 самыми С-концевыми остатками каждой цепи (площадь скрытой поверхности 1100 Å 2 ).

Поиск сходства на основе структуры для определения возможных функций

Для идентификации известных структурных гомологов нашей структуры мы использовали программу DALI для сравнения структур белков [14] и выполнили поиск по всему мономеру и по двум доменам по отдельности.Для преимущественно α-спирального домена 1 не удалось идентифицировать значимое попадание. Результаты включали различные белки, такие как экспортины, импортины, протеинфосфатазы, белки, связанные с цитоскелетом, глутатион-S-трансферазу, а также субъединицу eIF4G фактора инициации трансляции эукариот 4F. Все эти совпадения имели очень низкие Z-баллы (<4,6) и не имели убедительного структурного сходства с L-Cterm.

Интересно, что для домена 2 L-Cterm список содержал кэп-связывающий домен PB2 вируса гриппа, который также был обнаружен при использовании полного мономера L-Cterm CASV в качестве модели поиска.Другими попаданиями для домена 2 были ацетилтрансферазы, сульфатазы, метилтрансферазы, β-лактамазы и связывающие ТАТА-боксы белки, опять же с относительно низкими Z-баллами (<5,0).

Структурное сходство между CASV L-Cterm и вирусом гриппа PB2

Несмотря на полное отсутствие гомологии последовательностей, CASV L-Cterm и грипп PB2 демонстрируют заметное сходство в общей архитектуре домена и топологии субдомена (рис. нарисованы в соответствии со структурой из исх.[15]). Во-первых, часть I домена 1 L-Cterm CASV (остатки 1721–1790) подобна среднему домену PB2 вируса гриппа. Оба состоят из четырех α-спиралей, за которыми следует петля, соединяющаяся с доменом 2 L-Cterm или кэп-связывающим доменом PB2, соответственно (фиг. И). Во-вторых, часть II L-Cterm-домена 1 (остатки 1896-1924) подобна связывающей области PB2; оба содержат трехцепочечный β-лист (фиг. и). В-третьих, часть III L-Cterm-домена 1 (остатки 1925–2046) соответствует 627-домену PB2.Обе области содержат α-спиральный пучок, за которым следует небольшой четырехцепочечный β-лист, хотя и в разной ориентации (). Только кислый C-концевой хвост CASV L-Cterm (см. Также S2 и S10 фиг.) Отсутствует у вируса гриппа, который вместо этого имеет небольшой домен, содержащий последовательность терминальной ядерной локализации.

Сравнение структуры CASV L-Cterm со структурой вируса гриппа PB2 (PDB ID 5FMM).

A) Сравнение доменов в PB2 и L-Cterm. Идентификаторы участков внутри белка показаны в столбцах.Домен 1 (D1) L-Cterm разделен на три части (D1-I, D1-II и D1-III). Линкеры к домену 2 или кэп-связывающему домену окрашены в желтый цвет. Под полосами указаны номера остатков разноцветных областей. Помечены N- и C-концы. Отсутствующие на рисунке C-концевые части PB2 обозначены пунктирными линиями. B) Структуры частей I и II домена L-Cterm 1 (левая панель) и доменов среднего звена PB2 (правая панель) показаны в виде ленточных диаграмм. Цвета имеют кодировку, представленную в A).Линкеры к домену 2 и кэп-связывающему домену показаны желтым цветом. N-концы помечены. C) Сравнение домена 2 L-Cterm (левая панель) с доменом связывания кэп PB2 (правая панель) со структурами, представленными в виде ленточных диаграмм. Конструктивно похожие элементы имеют похожие цвета. Ссылки на другие домены выделены желтым цветом. D) Структурное сравнение частей II и III домена L-Cterm 1 (левая панель) и доменов link-627 PB2 (правая панель). Структуры показаны в виде ленточных диаграмм.Цвета обозначены как в А). β-цепи части III L-Cterm домена 1 и 627-домена PB2 окрашены в красный цвет. С-концы помечены.

Топологический обзор структур CASV L-Cterm и PB2 вируса гриппа.

Схематическое изображение общей доменной архитектуры A) CASV L-Cterm домен 1 – части I и II (окрашены синим и бирюзовым цветом соответственно) и домен 2 (окрашены зеленым цветом), а также B) мид-домен PB2 вируса гриппа (синий), кэп-связывающий домен (зеленый) и линкерный домен (бирюзовый).α-Спирали показаны как цилиндры, β-тяжи – как большие стрелки. N-концы помечены, а белковые части, которые следуют за представленными доменами, обозначены маленькой стрелкой с данными названиями.

Наиболее важно, что наивысшая степень сходства наблюдалась между доменом 2 L-Cterm и доменом связывания кэпа PB2 (). Оба образованы антипараллельным β-листом, упакованным против 3–4 α-спиралей. PB2 имеет структуру β-шпильки, вставленную между двумя цепями β-листа, которая отсутствует в домене 2 L-Cterm.Последний имеет только длинную петлю в гомологичном положении (рис. И). В PB2 колпачок связан между F404, выступающим из конца длинной спирали (справа, спираль показана светло-зеленым), и h457, расположенным в β-шпильке. Домен 2 L-Cterm также содержит ароматический остаток (Y1872) на конце гомологичной длинной спирали (левая панель), указывающий в том же направлении, что и F404 в PB2. Поскольку β-шпилька отсутствует в CASV L-Cterm, нет гомолога для остатка гистидина.Возможным кандидатом в L-Cterm для образования ароматического сэндвича, как видно в PB2 [9], может быть W1818, который выступает из второй β-цепи. Однако этот остаток не находится в конформации для образования ароматического сэндвича, как это видно в PB2. Гипотетические конформационные изменения, необходимые для того, чтобы боковая цепь W1818 участвовала в таком взаимодействии, невозможны в нашей структуре, поскольку P1810 из соседней петли тесно взаимодействует с W1818 и удерживает петлю и, следовательно, боковую цепь W1818 на месте (). В заключение, домен L-Cterm 2 структурно подобен домену связывания кэпа PB2, хотя типичный ароматический сэндвич для связывания кэпа не является полным.

Исследование кэп-связывания L-Cterm CASV по сравнению с вирусом гриппа PB2.

A) Сравнение домена 2 L-Cterm CASV (левая панель) с кэп-связывающим доменом PB2 (PDB ID 2VQZ, правая панель) со структурами, представленными в виде ленточных диаграмм. Конструктивно похожие элементы имеют одинаковый цвет. Потенциальные связывающие кэп ароматические остатки в CASV L-Cterm и фактические связывающие кэп остатки в PB2 показаны в виде полосок и окрашены в оранжевый цвет. Связано m 7 Молекулы GTP показаны в виде палочек. B) На рисунке показано связывание m 7 GTP с димером CASV L-Cterm в кристалле после экспериментов с пропиткой. Показаны обзор (слева) и крупный план (справа). CASV L-Cterm представлен в виде ленточной диаграммы, а остатки, относящиеся к связыванию, показаны в виде полосок. m 7 GTP показан в виде стержней, а окружающая электронная плотность (2 | Fo | – | Fc | карта на 2σ) – в виде синей сетки. C) Взаимодействие W1818 с P1810 из соседнего контура. Домен 2 CASV L-Cterm показан в виде зеленой ленточной диаграммы, потенциальные связывающие кэп остатки Y1872 и W1818 показаны оранжевыми полосками, а P1810 – синими полосками.

Помимо структурной организации изолированных доменов, их расположение в первичной структуре консервативно между вирусом гриппа и CASV (рис. И): как в PB2, так и в L-Cterm домен связывания кэпа и домен 2, соответственно, вставлены в полипептидная цепь в аналогичных положениях через два гибких линкера.

Исследования связывания кэпа с использованием CASV L-Cterm

Чтобы проверить, может ли CASV L-Cterm связываться с кэп-структурами, несмотря на неблагоприятное расположение ароматических остатков в кристалле, мы провели несколько экспериментов с использованием кэп-аналога m 7 GTP.Сначала кап-аналог пропитался кристаллами CASV L-Cterm. Однако электронная плотность не появилась в полости, образованной Y1872, F1806 и W1818, то есть в положении, ожидаемом по сравнению с PB2 (). Вместо этого кэп-аналог был связан с F1839 на периферии β-слоя между двумя мономерами CASV L-Cterm. Не было обнаружено второго ароматического остатка ни в одной молекуле, связанной с симметрией, что позволяет предположить, что m 7 GTP не был связан аутентичным сайтом связывания кэпа. Фактически наблюдаемая электронная плотность не была ни сильной, ни покрывающей всю молекулу m 7 GTP ().Как уже упоминалось, димерная форма белка в кристалле не является полностью симметричной, и мы обнаружили, что m 7 GTP связывается только между доменом 2 цепи A и доменом 1 цепи B, где граница раздела немного более открыта по сравнению с Интерфейс между доменом 2 цепи B и доменом 1 цепи A. Мы также тестировали способность CASV L-Cterm связываться с кэпом в анализах m 7 GTP-агарозы. Принимая во внимание, что PB2 и эукариотический фактор инициации 4E (eIF4E), эукариотический белок, связывающий кепку, связанный с m 7 GTP-агарозой, мы не смогли обнаружить связывание CASV L-Cterm (S6A фиг.).Кроме того, мы не смогли наблюдать влияние m 7 GTP на термостабильность CASV L-Cterm или связывание CASV L-Cterm с кэпированной РНК в анализе смещения радиоактивного геля (S7 и S6B фиг.).

Роль димеризации белка и домена 1 для функции связывания кэпа

Образование димера, наблюдаемое для CASV L-Cterm как в растворе, так и в кристалле, предположительно является артефактом из-за экспрессии изолированного С-концевого фрагмента L-белка. белка и не существует в контексте полноразмерного L-белка.Поскольку предполагаемый сайт связывания кэпа находится близко к интерфейсу димера, мы проверили, может ли присутствие L-Cterm домена 1 и / или димеризация CASV L-Cterm препятствовать связыванию белка с m 7 GTP путем блокировки белок в неприродной конформации. С этой целью мы попытались заблокировать димеризацию L-Cterm. Мы проанализировали интерфейс димера и разработали мутантный белок, в котором отсутствуют C-концевые 14 остатков (deltaC). Эти в основном отрицательно заряженные остатки взаимодействуют с положительно заряженным участком на второй молекуле (S10 фиг.), Образуя одну треть границы раздела димера.Конструкция deltaC действительно была чисто мономерной согласно измерениям SAXS (S1C фиг.), Однако она не связывалась с m 7 GTP-агарозой (S6A фиг.) И не была термически стабилизирована m 7 GTP (S7 фиг.). Хотя слабое связывание с РНК наблюдалось в анализах сдвига геля, это сродство не было кэп-специфичным (S6B и S6C фиг.). Поэтому дальнейшие эксперименты с этим фрагментом не проводились.

Чтобы дополнительно подтвердить, что домен L-Cterm 1 не влияет на конформацию домена L-Cterm 2, мы кристаллизовали и решили структуру изолированного домена 2 (, таблица S1).Эта структура была уточнена до разрешения 1,8 Å. CASV L-Cterm домен 2 также кристаллизовался в виде димера, но – из-за отсутствия домена 1 – с совершенно другим и гораздо меньшим интерфейсом по сравнению с CASV L-Cterm. Белок также проявлялся в виде димера в растворе, как показано SAXS (и S1B фиг.). Наложение изолированного домена Cterm 2 на его аналог в полной структуре L-Cterm CASV показывает только небольшие различия в петле перед W1818 и отсутствие значительной перестройки потенциальных связывающих кэп боковых цепей, даже несмотря на то, что B-факторы относительно высоки вокруг предполагаемый сайт связывания кепки ().Совместная кристаллизация домена с m 7 GpppG, m 7 GTP, GTP или ATP не привела к дополнительной электронной плотности.

Атомная структура изолированного домена 2 CASV L-Cterm

A) Ленточная диаграмма структуры домена 2 L-Cterm CASV. Цепь A показана бледно-зеленым цветом, цепь B – серым. N- и C-концы отмечены, а потенциальные связывающие кэп ароматические боковые цепи Y1872 и W1818 показаны в виде полосок и окрашены в оранжевый цвет. B) Наложение полученной методом SAXS молекулярной формы L-Cterm в концентрации 4.5 мг / мл и ленточная диаграмма кристаллической структуры. C) Наложение ленточных диаграмм цепочек A и B из изолированной кристаллической структуры CASV L-Cterm domain 2 (пурпурный и желтый, соответственно) и кристаллической структуры L-Cterm (зеленый). Потенциальные ароматические боковые цепи, связывающие кэп, выделены насыщенными цветами. D) Представление цепи B домена L-Cterm 2, окрашенного B-фактором, при этом наибольшее наблюдаемое значение B составляет 106 (оранжевый), а наименьшее 22 (темно-синий).

Опять же, мы не обнаружили связывания с m 7 GTP-агарозой изолированного домена 2 CASV L-Cterm (S6A фиг.), Ни термостабилизации белка с помощью m 7 GTP (S7 фиг.).Предполагая, что одной кэп-структуры может быть недостаточно для связывания, мы также провели эксперименты по связыванию в нативном геле с использованием кэпированной РНК. Мы обнаружили сдвиг РНК с PB2, но не с L-Cterm доменом 2 (S6B на фиг.).

Поскольку ни мономерная форма CASV L-Cterm (deltaC), ни димерная форма с другим димерным интерфейсом (домен 2) не связывает m 7 GTP, мы заключаем, что димеризация белка и присутствие домена 1 не связаны с не несет ответственности за отсутствие кэп-связывающей активности.

Определение структуры эндонуклеазы CASV

Механизм захвата кэпа был предложен и охарактеризован до сих пор только для маммаренавирусов на основании (i) результатов секвенирования, показывающих 4-5 нетемплатированных нуклеотидов на 5′-конце вирусных мРНК и ( ii) структурные и функциональные данные, демонстрирующие наличие эндонуклеазы на N-конце L-белка [4, 5, 16]. Таким образом, мы стремились предоставить дополнительные доказательства механизма захвата крышки у рептаренавирусов.Мы сосредоточились на N-конце белка L, где должна располагаться эндонуклеаза.

При выравнивании последовательностей N-концов белка L аренавируса было обнаружено, что ключевые остатки активного сайта эндонуклеазы являются высококонсервативными во всем семействе вирусов, даже в рептаренавирусах (S8 фиг.). Таким образом, мы экспрессировали и очистили первые 205 остатков белка L CASV в виде белка, меченного His на N-конце. Как и ожидалось, исходя из металлзависимого ферментативного механизма вирусных эндонуклеаз, анализы термостабильности показали зависящую от концентрации стабилизацию белка ионами марганца с повышением температуры плавления до ~ 10 ° C при концентрации 10 мМ марганца (концентрация белка в пробирке 4.2 мкМ) (). После расщепления His-tag белок кристаллизовался, и кристаллы дифрагировали с разрешением 1,9 Å. Молекулярная замена с использованием любой из трех известных структур эндонуклеаз аренавируса или их субдоменов в качестве моделей поиска не увенчалась успехом. Поэтому мы экспрессировали белок селенометионинами и кристаллизовали его после расщепления His-tag в присутствии ионов марганца. Фазы были определены с использованием метода одиночной аномальной дисперсии и использованы для решения структуры с набором данных из лучших дифрагирующих собственных кристаллов.Структура уточнена до разрешения 1,9 Å. Нативный белок кристаллизовался в пространственной группе P2 1 2 1 2 1 с четырьмя молекулами на асимметричную единицу. Структуры четырех молекул очень похожи с единственной разницей в 15 остатках на С-конце, которые не видны во всех молекулах (среднеквадратичное отклонение от 0,227 до 0,317 Å). Эндонуклеаза CASV имеет в основном такую ​​же укладку, что и эндонуклеазы из LASV, вируса Pichinde (PICV) и вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) (, таблица S1), хотя аминокислотная последовательность этого белка вряд ли консервативна среди этих вирусов (идентичность варьируется от 20–55% и сходство в пределах от 54 до 79%, S11 рис.).Небольшие различия между структурами наблюдались в длинной α-спирали, параллельной β-листу (, α-спираль показана оранжевым), которая разделена на две спирали в домене эндонуклеазы CASV по сравнению с другими структурами, а также в Спиральная область, показанная зеленым цветом, состоит из четырех-шести спиралей разной длины и ориентации. RMSD между структурами находится в диапазоне от 1,372 Å (CASV по сравнению с LCMV) до 1,856 Å (CASV по сравнению с LASV). Высококонсервативные остатки активного сайта эндонуклеазы расположены так же, как и в других структурах эндонуклеазы аренавируса ().Электростатический поверхностный потенциал эндонуклеазы CASV также сопоставим с другими эндонуклеазными структурами с положительно заряженными участками рядом с отрицательно заряженной полостью активного сайта (). Мы также тестировали на эндонуклеазную активность, используя ранее установленный анализ расщепления РНК [17], однако мы не наблюдали ферментативной активности изолированного домена (S9 Рис).

Структура и термостабилизация эндонуклеазы CASV.

A) Ленточная диаграмма кристаллической структуры эндонуклеазы CASV.N- и C-концы помечены, а остатки активного сайта показаны в виде стержней. Консервативный β-лист и длинная α-спираль окрашены в оранжевый цвет, консервативный домен спирального пучка – в зеленый, а оставшаяся часть с петлями и α-спиралями – в желтый. B) Структуры эндонуклеаз LASV (PDB ID 5J1P), LCMV (PDB ID 3JSB) и PICV (PDB ID 4I1T) показаны в виде ленточных диаграмм и окрашены в соответствии с эндонуклеазой CASV на A). Ионы марганца LASV-структуры 5J1P показаны красными сферами, остатки активного центра показаны стержнями, а N- и C-концы отмечены. C) Электростатический поверхностный потенциал эндонуклеазных структур, показанных на A) и B). Поверхностный потенциал показан от -5 KT / e красным цветом до +5 KT / e синим и был рассчитан с использованием PDB2PQR и APBS-инструмента PyMOL. D) Температурная стабильность эндонуклеазы CASV в зависимости от концентрации Mn 2+ . Температуры плавления представлены как среднее значение и стандартное отклонение трех независимых измерений. Стабильность белка тестировали в присутствии различных концентраций Mn 2+ и в присутствии 10 мМ EDTA. E) Крупным планом наложенные активные сайты эндонуклеаз структур, показанных на A) и B). Консервативные остатки активного сайта показаны в виде стержней, а ионы марганца со структурой 5J1P LASV показаны красными сферами.

Обсуждение

Отрывание крышки было впервые обнаружено у вируса гриппа [8]. Структуры отдельных ответственных доменов, а именно эндонуклеазы в PA и кэп-связывающего домена в PB2, были решены [9–11]. На основании структуры полной полимеразы вируса гриппа был предложен механизм захвата кэпа и зависимой от кэп транскрипции [18].Механизм захвата крышки является привлекательной мишенью для лекарств, поскольку соответствующие функциональные домены полимеразы являются как важными, так и вирусоспецифичными. После идентификации нетематических производных от хозяина последовательностей на 5′-концах мРНК других сегментированных вирусов РНК с отрицательной цепью было высказано предположение, что захват кэпа является обычным механизмом для этих вирусов [4, 6, 7, 19-24]. Однако, в отличие от эндонуклеазы, которая, как недавно было показано, расположена на самом N-конце L-белка маммарена-, ортобуниа и хантавирусов с использованием структурных и молекулярно-биологических методов [5, 16, 17, 25, 26], кэп-связывающий домен до сих пор не был идентифицирован ни у одного арено- или буньявируса.

Мы выяснили структуру 326 С-концевых остатков белка L рептаренавируса. Несмотря на отсутствие какой-либо значительной гомологии последовательностей, домены этого фрагмента 37 кДа структурно подобны кэп-связывающим и соседним доменам вируса гриппа PB2 [15]. Оба белка имеют общую архитектуру в отношении линейного расположения доменов и элементов вторичной структуры. Наибольшая степень сходства наблюдается между кэп-связывающим доменом PB2 и доменом 2 L-Cterm.Сравнение этих двух доменов привело нас к идентификации потенциального сайта связывания кэпа в L-Cterm. Однако этот сайт не имеет типичного сэндвича из двух ароматических остатков [27]. Хотя один ароматический остаток (Y1872) находится в положении, аналогичном его предполагаемому гомологу в PB2, шпилька, которая обеспечивает второй ароматический остаток в PB2, отсутствует в CASV. Несколько попыток биохимической или структурной проверки наличия функционального сайта связывания кэпа не увенчались успехом. Кроме того, мы решили кристаллическую структуру соответствующей эндонуклеазы на N-конце белка L рептаренавируса.Он показывает типичную эндонуклеазную складку, обнаруженную в других сегментированных вирусах с отрицательной цепью РНК, и топологию активного сайта, которая по существу идентична таковой у известных эндонуклеазных структур маммаренавируса [5, 10, 17, 26, 28].

Главный вопрос, возникающий из этих данных, заключается в том, содержит ли L-белок CASV – и, следовательно, L-белок других аренавирусов – функциональный механизм захвата крышки, как это описано для полимеразы вируса гриппа? Из экспериментов с репликонными системами для LASV и LCMV ясно видно, что эндонуклеаза на N-конце белка L важна для транскрипции вируса [5, 25].Структуры, полученные для эндонуклеазных доменов LASV и LCMV, в частности, конформация активных центров, указывают на существование функционального фермента, даже несмотря на то, что каталитическая активность выделенных доменов отсутствует или низкая по сравнению с эндонуклеазами вируса гриппа или буньявирусов [5, 10, 17, 26]. Консервативная топология активного сайта в структуре эндонуклеазы CASV и стабилизация белка с помощью Mn 2+ являются сильными аргументами в пользу присутствия функциональной эндонуклеазы в белке L рептаренавирусов, даже если она идентична изолированному эндонуклеазному домену LASV. , биохимическая активность нуклеаз не определялась [26].Как показано для эндонуклеазы вируса гриппа, возможна активация фермента в контексте полного L-белка, отчасти из-за усиленного связывания РНК [15]. К сожалению, мы не можем предоставить функциональные данные об участии эндонуклеазы CASV в вирусной транскрипции, так как системы репликонов для рептаренавирусов недоступны. Тем не менее, в сочетании с имеющимися данными по маммаренавирусам [5, 16, 25, 26] мы считаем структурные данные, представленные здесь, достаточными, чтобы утверждать о существовании эндонуклеазы, захватывающей кепку, в рептаренавирусах, даже без биохимических доказательств.

В отличие от эндонуклеазы, как структурные, так и биохимические данные предполагают, что предполагаемый сайт связывания кэпа на С-конце белка L CASV не является функциональным. Данные, полученные с мутантом с дефицитом димеризации и изолированным доменом 2 L-Cterm, исключают, что взаимодействие между доменами 1 и 2 на границе димеризации объясняет отсутствие функционального сайта связывания кэпа.

Мы также не смогли продемонстрировать ни связывание C-концевых фрагментов L-белка маммаренавирусов с m 7 GTP или кэпированной РНК, ни термостабилизацию этих белков с помощью m 7 GTP (показано для растворимого фрагмента L-Cterm LASV в S6 и S7 фиг.), Что указывает на то, что неспособность связывать кэп-структуры не является специфической для CASV.

В предыдущем исследовании мы идентифицировали несколько аминокислотных остатков на С-конце белка LASV L, которые имеют решающее значение для вирусной транскрипции, но не обязательны для репликации генома [13]. Однако присутствие сайта связывания кэпа не могло быть предположено, так как не существует мотива, облегчающего его идентификацию на уровне последовательности [27]. Чтобы сопоставить эти функциональные данные из LASV с нашей атомной структурой CASV L-Cterm, мы попытались выровнять первичные последовательности обоих белков. К сожалению, это было невозможно из-за чрезвычайно низкой консервативности последовательности на С-конце белков аренавируса L (S12, фиг.).Поэтому мы использовали предсказанные вторичные структуры C-концов LASV и других белков L аренавируса [29–31] вместе с определенной вторичной структурой из кристаллических структур PB2 вируса гриппа и CASV L-Cterm в качестве руководства для предложения выравнивания последовательностей этих вирусы (S2 фиг.). Хотя это выравнивание следует интерпретировать с осторожностью, оно облегчило вывод LASV-аналогов остаткам белка L CASV, потенциально участвующим в связывании кэпа, и наоборот (S3 Fig). В частности, остаток F2042 в белке LASV L оказался лучшим кандидатом в гомолог Y1872 в белке L CASV и F404 в вирусе гриппа PB2.Мы протестировали различные мутанты LASV-белка с заменами в этом и соседних положениях в системе минирепликонов LASV (S3 и S4, фиг., S2, таблица). Наиболее важно то, что F2042 в LASV-белке может быть заменен полярным и гидрофильным серином без какого-либо влияния на транскрипционную активность L-белка. Этот фенотип несовместим с функцией этого остатка в ароматическом сэндвиче для связывания с кэпом. Кроме того, у некоторых аренавирусов Нового Света отсутствует ароматический остаток в области, соответствующей F2042 в LASV L [13].С другой стороны, селективный дефект транскрипции, наблюдаемый с мутантами LASV L-белка W1915E, E2041L, E2041K и F2042D (S4 Fig), подтверждает наши предыдущие выводы о том, что C-конец белка L аренавируса каким-то образом участвует в вирусной транскрипции [13] . Согласно выравниванию последовательностей на S3 Фиг., Остатки, участвующие в транскрипции LASV, картируются в различные области обоих доменов 1 и 2 CASV L-Cterm (S5 Фиг.). Возможное объяснение фенотипа с дефектом транскрипции соответствующих мутантов состоит в том, что эти остатки играют роль в структурной целостности С-конца или во взаимодействиях с другими вирусными или клеточными факторами, участвующими в вирусной транскрипции.Таким образом, структура CASV L-Cterm, данные минирепликона LASV, а также анализы связывания кэпа и термического сдвига в совокупности указывают на отсутствие функционального сайта связывания кэпа в этой области.

Явное структурное сходство между вирусом гриппа PB2 и CASV L-Cterm согласуется с филогенетическим родством вируса гриппа и аренавирусов. Функция связывания кэпа могла быть потеряна во время эволюции аренавируса, в то время как домен мог получить или сохранить другие функции в транскрипции вируса [13].Аналогичная ситуация была предложена для вируса Тогото, ортомиксовируса, передаваемого насекомыми. Субъединицы PA и PB2 полимеразы тоготовируса содержат домены, структурно похожие на эндонуклеазные и кэп-связывающие домены полимеразы вируса гриппа, но с аминокислотными заменами в обоих активных сайтах, которые делают их функционально неактивными [32]. Гипотеза о нефункциональном сайте связывания кэпа в CASV будет означать, что механизм захвата кэпа у рептаренавирусов и, возможно, аренавирусов в целом отличается от механизма вируса гриппа.Действительно, существуют значительные различия в инициации транскрипции между обоими вирусными семействами. Вирус гриппа зависит от ядерной РНК-полимеразы II как поставщика кэпированной РНК клетки-хозяина [33]. Поскольку аренавирусы реплицируются в цитоплазме, они, должно быть, приобрели другой источник клеточно-кэпированных РНК. Это может включать клеточные связывающие кэп белки [34], которые могут замещать кэп-связывающий домен в L-белке. Кроме того, более 50% белка аренавируса L не было ни структурно охарактеризовано, ни назначено четкой функции.Таким образом, все еще возможно, что другой сайт связывания кэпа может присутствовать даже в белке L, хотя в соответствующей области белка L буньявируса не обнаружено никакого домена связывания кэпа [28]. NP-аренавирус также был предложен в качестве связывающего кэп белка [35], хотя эта гипотеза не могла быть подтверждена с использованием системы минирепликонов LASV [36], а в кристаллической структуре комплекса NP-РНК предполагаемый сайт связывания с кэпом оказался для быть сайтом связывания РНК [37].

Альтернативная и спекулятивная гипотеза состоит в том, что потенциальный сайт связывания кэпа в CASV может быть способен принимать альтернативные конфигурации; сайт связывания может переключаться между активной и неактивной конформациями.Они могут, например, соответствовать режиму транскрипции и репликации белка L соответственно. Предполагаемый сайт связывания кэпа в CASV L-Cterm, неактивный в отдельности, может активироваться в физиологическом контексте RNP в результате взаимодействий с другими частями белка L, другими вирусными белками, такими как NP или Z [38-40] , клеточные факторы, вирусная РНК и / или РНК клетки-хозяина. Гипотетический вирусный или клеточный партнер может вызывать конформационные изменения, которые облегчают образование функционального сайта связывания кэпа.Связывание вирусной РНК также оказывает значительное влияние на конфигурацию кэп-связывающего и эндонуклеазного доменов в контексте полного полимеразного комплекса вируса гриппа [15, 41]. Более того, индуцированная подгонка неизвестна для связывающих кэп белков: напр., Связывающие кэп боковые цепи eIF4E подвергаются значительной перестройке при связывании лиганда [42].

В заключение мы решили структуры изолированных N- и C-концов белка L CASV. N-конец содержит предположительно активную эндонуклеазу, захватывающую кэп, которая структурно подобна своим гомологам из маммаренавирусов.С-конец демонстрирует структурное сходство с кэп-связывающим белком PB2 вируса гриппа, хотя сайт связывания кэп не является функциональным в изолированном домене. Наши данные дают представление о возможных сценариях инициации транскрипции у аренавирусов. Будущие эксперименты в контексте полноразмерного белка L могут прояснить подробные механизмы.

Методы

Клонирование, экспрессия и очистка С-конца L-белка аренавируса

На основе сопоставления С-концевых последовательностей L-белка аренавируса мы разработали конструкции для экспрессии L-белка различной длины для 20 видов аренавирусов, охватывающих полный филогенетический спектр .Все последовательности были клонированы в векторы pOPINF [43] с использованием набора In-Fusion HD EcoDry Cloning Kit (Clontech). Растворимость фрагментов оценивали на установке средней производительности с различными E . Штаммы coli , автоиндукционная среда и мелкомасштабная очистка His-tag, а также экспрессия и очистка, оптимизированные для растворимых белков. CASV L-Cterm и домен 2 были экспрессированы в E . coli штамм BL21 Gold (DE3) (Novagen) при 17 ° C в течение ночи с использованием среды TB и 0.5 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозид для индукции. После гранулирования клетки ресуспендировали в 50 мМ Трис, pH 8,0, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида, 0,4% (об. / Об.) Тритона X-100 и 0,025% (мас. / Об.) Лизоцима, а затем нарушено ультразвуковой обработкой. Белок очищали от растворимой фракции после центрифугирования с помощью Ni-аффинной хроматографии. Буфер, содержащий 50 мМ имидазола, использовали для стадий отмывки, а другой буфер с 500 мМ имидазола для элюирования белка.За аффинной хроматографией следовала эксклюзионная хроматография (Superdex 200, 50 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10% глицерин, 2 мМ дитиотреитол) и удаление N-концевой His-метки с помощью GST-меченной 3C протеазы при 4 ° C в течение ночи. Кроме того, белок очищали анионообменной хроматографией (загрузочный буфер: 50 мМ Трис, pH 7,5, 100 мМ NaCl, элюирование солевым градиентом до 1М NaCl) и эксклюзионной хроматографией второго размера (см. Выше). Очищенные белки концентрировали на центрифугах, быстро замораживали в жидком азоте и хранили в аликвотах при –80 ° C.

Клонирование, экспрессия и очистка эндонуклеазы CASV

На основе сопоставления N-концевых последовательностей L-белка аренавируса мы разработали конструкции L-белка различной длины для эндонуклеазы CASV. Процедуры клонирования, тестирование растворимости и крупномасштабную экспрессию в основном выполняли, как описано для конструкций CASV L-Cterm. После осаждения клетки ресуспендировали в 50 мМ Na-фосфате, pH 6,8, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазоле и полном ингибиторе протеазы, не содержащем EDTA (Roche). E . coli разрушали обработкой ультразвуком, и белок очищали с помощью Ni-аффинной хроматографии из растворимой фракции после центрифугирования. Буфер, содержащий 50 мМ имидазола, использовали для стадий отмывки, и белок элюировали буфером, содержащим 100 мМ Na-фосфат, pH 6,8, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазол. His-tag удаляли инкубацией с GST-меченной 3C протеазой при 4 ° C в течение ночи с одновременным диализом против 20 мМ Tris pH 7,5, 100 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 2.5% глицерин. Кроме того, белок очищали с помощью анионообменной хроматографии (элюирование солевым градиентом до 1 М NaCl) и эксклюзионной хроматографии (Superdex 200, 20 мМ Na-фосфат, pH 6,0, 300 мМ NaCl и 5% глицерин). Очищенные белки концентрировали на центрифугах, быстро замораживали в жидком азоте и хранили в аликвотах при –80 ° C.

Производство меченого селенометионином белка

Экспрессию белка проводили в минимальной среде M9 [44] с добавлением 1 мМ MgSO 4 ,0.4% глюкозы, 0,0005% тиамина и 200 мкМ FeSO 4 при 17 ° C в течение ночи. Включение селенометионина было достигнуто путем метаболического ингибирования биосинтеза метионина в E . coli до добавления селенометионина и индукции 1 мМ изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом. Клетки собирали, и меченый белок очищали, как описано, но в присутствии 5 мМ β-меркаптоэтанола для аффинной очистки Ni и 10 мМ дитиотреитола для остальных стадий очистки.

Кристаллизация и определение структуры CASV L-Cterm и домена 2

Белок CASV L-Cterm был получен с помощью селен-метионинового мечения. Кристаллы протеина росли при концентрации протеина 12 мг / мл в 37% Jeffamine ED-2001, 2 мМ TCEP и 100 мМ HEPES pH 7,1 в установке для диффузии паров сидячей капли при 20 ° C. Домен 2 L-Cterm кристаллизовался в присутствии 100 мМ трис, pH 7,9, 1,3 М тринатрийцитрата при концентрации белка 10 мг / мл путем диффузии паров из сидячей капли при 20 ° C.Кристаллы мгновенно замораживали в жидком азоте с 30% глицерином в качестве криозащитного агента. Наборы данных для CASV L-Cterm были получены на канале ID29 ESRF, Гренобль, Франция. Данные для кристаллов L-Cterm домена 2 были собраны на каналах P13 и P14 PETRA III на синхротроне Deutsches Elektronen (DESY), Гамбург, Германия. Наборы данных обрабатывались с помощью iMosflm [45]. Фазы для структуры CASV L-Cterm были определены с использованием метода одиночной аномальной дисперсии и PHENIX AutoSol [46], а затем использованы для расчета структуры с новым набором данных из кристаллов с улучшенной дифракцией.Структура домена L-Cterm 2 была решена путем молекулярного замещения структурой CASV L-Cterm с использованием остатков 1794–1894 и PHASER [47]. Обе структуры были уточнены с помощью итерационных циклов ручного построения модели в Coot [48] и вычислительной оптимизации с помощью PHENIX [46]. Визуализация структурных данных была сделана с использованием PyMOL (PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.7 Schrödinger, LLC.) И UCSF Chimera [49]. Электростатические поверхности рассчитывались с использованием PDB2PQR и APBS [50, 51].

Кристаллизация и определение структуры эндонуклеазы CASV

Белок эндонуклеазы CASV продуцировали как нативный белок (Endo нативный ) и с селено-метиониновой меткой (Endo SeMet ), соответственно.Кристаллы белка нативного белка Endo росли при концентрации белка 10 мг / мл в 20% PEG 200, 2,5% PEG 3000 и 100 мМ MES, pH 5,7, тогда как белок Endo SeMet кристаллизовался в присутствии 2% 2. -пропанол, 8% PEG 4000, 7 мМ MnCl 2 и 100 мМ Na-цитрат, pH 5,4, при концентрации белка 8 мг / мл. Кристаллы были получены на установке диффузии пара из сидящей капли при 6–8 ° C. Кристаллы мгновенно замораживали в жидком азоте с 30% ПЭГ 400 (Endo нативный ) или 20% этиленгликоля (Endo SeMet ) в качестве криозащитных средств.Наборы данных для обоих белков были собраны на линиях передачи P13 и P14 PETRA III в DESY, Гамбург. Наборы данных обрабатывались с помощью iMosflm [45], а структура Endo SeMet была расшифрована методом единичной аномальной дисперсии с использованием PHENIX AutoSol [46]. Нативная структура Endo была решена путем молекулярного замещения структурой Endo SeMet с использованием только цепи A и PHASER [47]. Уточнения, визуализация структур и расчет электростатических потенциалов поверхности выполнялись как для CASV L-Cterm.

Анализ термостабильности

Термостабильность эндонуклеазы CASV измеряли с помощью термофлуоресцентного анализа [52]. Анализ содержал конечную концентрацию белка эндонуклеазы 4,2 мкМ, 100 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl, SYPRO-Orange (конечное разведение 1: 1000) и либо 10 мМ ЭДТА, различные концентрации MnCl 2 или нет. другие добавки.

Температурную стабильность белков CASV L-Cterm, LASV L-Cterm и PB2 вируса гриппа тестировали в присутствии и в отсутствие m. 7 GTP, GTP и ATP.Конечная концентрация белка в этих анализах составляла от 4 до 17 мкМ (CASV L-Cterm 5,3 мкМ, L-Cterm deltaC 5,6 мкМ, L-Cterm домен 2 17,0 мкМ, LASV L-Cterm 4,1 мкМ и PB2 10,6 мкМ). Реакции проводили в 100 мМ Трис, pH 7,5, 150 мМ NaCl и SYPRO-Orange.

Анализ связывания с кэпом.

Белки инкубировали в течение ночи при 4 ° C или в течение 2 часов при 20 ° C в концентрации 50 мкг / мл с m. ) соответственно в буфере, содержащем 50 мМ Трис, pH 7.5, 150 мМ NaCl, 10% глицерина и 0,005% Твина 20. Гранулы агарозы тщательно промывали указанным буфером, и к ним добавляли буфер SDS для образцов для последующего анализа SDS-PAGE.

Анализ сдвига радиоактивной электрофоретической подвижности

40-мерный субстрат полиА-РНК продуцировали путем транскрипции in vitro и радиоактивно метили путем кэпирования кэпирующими ферментами (Cellscript) и α 32 P-GTP. Параллельно синтетическая полиА 40-мерная РНК была помечена полинуклеотидкиназой Т4 (New England Biolabs) и γ 32 P-ATP.Затем субстраты РНК очищали на колонке Microspin G25 (GE Healthcare). Реакции, содержащие 5 пмоль белка и 0,4 пмоль общей РНК (фракция радиоактивно меченой РНК была постоянной во всех реакциях и корректировалась для облегчения надлежащего обнаружения), были установлены в присутствии 0,5 Ед / мкл РНКазина (Promega), 20 мМ HEPES, pH 7,3. , 70 мМ KCl, 5 мМ MgCl 2 , 0,7 мМ дитиотреитола, 15% глицерина и 0,7 мкг / мкл бычьего сывороточного альбумина и инкубировали в течение 45 мин при 20 ° C. Образцы подвергали электрофорезу в нативном геле с использованием гелей 4% полиакриламид, трис-борат-ЭДТА и 0.5-кратный трис-боратный буфер. Температура геля во время электрофореза поддерживалась низкой. Сигналы визуализировали с помощью авторадиографии с люминесцентным экраном с использованием сканера Typhoon (GE Healthcare).

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

Измерения малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) проводили после эксклюзионной хроматографии в соответствующих буферах, упомянутых в процедурах очистки белков, с различными концентрациями белка (обычно 0,5–5 мг / мл). Данные были собраны на канале SAXS P12 накопительного кольца PETRA III DESY, Гамбург, Германия [53].Используя пиксельный детектор PILATUS 2M на расстоянии до образца 3,1 м и энергии 10 кэВ (λ = 1,24 Å), был покрыт диапазон передачи импульса 0,01 Å –1 –1 (s = 4π sinθ / λ, где 2θ – угол рассеяния). Данные были проанализированы с помощью пакета ATSAS 2.6 [54]. Рассеяние вперед I (0) и радиус инерции Rg были извлечены из приближения Гинье, рассчитанного с помощью функции AutoRG в программе PRIMUS [55]. GNOM [56] предоставил функцию распределения пар частиц P (r), максимальный размер Dmax и объем Porod. Ab initio Реконструкции были созданы с помощью программы DAMMIF [57]. Десять независимых прогонов DAMMIF были наложены SUPCOMB [58] и усреднены с помощью программы DAMAVER [57]. Средний исключенный том был извлечен из окончательного pdb-файла. Структуры были визуализированы с помощью UCSF Chimera.

Дополнительная информация

S1 Рис.
Дополнительные данные для экспериментов SAXS.

A) Сравнение экспериментальных кривых рассеяния (серые точки) и теоретических кривых рассеяния для структуры CASV L-Cterm (красная линия).Приведено значение χ2. Теоретическая кривая была рассчитана и согласована с экспериментальными данными с использованием CRYSOL [59]. B) Сравнение экспериментальных кривых рассеяния (серые точки) и теоретических кривых рассеяния для структуры домена 2 CASV L-Cterm (красная линия). Приведено значение χ2. Теоретическая кривая была рассчитана и согласована с экспериментальными данными с использованием CRYSOL. C) График экспериментальных данных по рассеянию для CASV L-Cterm (черный) и мутанта L-Cterm deltaC (красный), измеренных при равных концентрациях.В таблице показана рассчитанная молекулярная масса (MW) по данным SAXS (полученная из объема Porod и среднего исключенного объема модели DAMFILT [57]) в сравнении с фактической MW белков.

(TIF)

S2 Рис.
Сопоставление С-концевых последовательностей аренавируса и PB2 вируса гриппа.

Выравнивание было создано путем ручного объединения результатов программ PRALINE, MUSCLE, ClustalOmega и Jpred4 [29–31, 60]. Первоначально он включал последовательности L-белка и предсказания вторичной структуры из 46 маммарен- и рептаренавирусов, которые были сокращены до восьми последовательностей для лучшего обзора.После добавления последовательности PB2 вируса гриппа выравнивание дополнительно корректировали вручную. Наконец, выравнивание включает последовательности белков L рептаренавирусов CASV (Uniprot-ID: J7HBG8) и аренавируса Boa NL (ROUTV, M4PUV6) и маммаренавирусов LASV ({“type”: “entrez-protein”, “attrs”: {“text” : “Q6Y630”, “term_id”: “75551266”, “term_text”: “Q6Y630”}} Q6Y630), вирус Мобала (MOBV, {“type”: “entrez-protein”, “attrs”: {“text”: «Q27YE5», «term_id»: «123827698», «term_text»: «Q27YE5»}} Q27YE5), LCMV ({«type»: «entrez-protein», «attrs»: {«text»: «P14240», “term_id”: “133636”, “term_text”: “P14240”}} P14240), вирус Хунин (JUNV, {“type”: “entrez-protein”, “attrs”: {“text”: “Q6XQI4″, ” term_id “:” 221272067 “,” term_text “:” Q6XQI4 “}} Q6XQI4), вирус Tacaribe (TACV, {” type “:” entrez-protein “,” attrs “: {” text “:” P20430 “,” term_id “:” 133654 “,” term_text “:” P20430 “}} P20430) и вирус Oliveros (OLVV, {” type “:” entrez-protein “,” attrs “: {” text “:” Q6XQH7 “,” term_id ” : “221272066”, “term_text”: “Q6XQH7”}} Q6XQH7), а также последовательность PB2 вируса гриппа A (FluA, {“type”: “entrez-protein”, “attrs”: {“text”: ” Q6DNN3 “,” term_id “:” 82052607 “,” term _text “:” Q6DNN3 “}} Q6DNN3).N- и C-концы домена 2 CASV L-Cterm отмечены красными треугольниками. Потенциальные кэп-связывающие ароматические остатки CASV отмечены оранжевой звездочкой. Консервативный C-концевой хвост аренавирусов выделен желтым прямоугольником. Вторичная структура кристаллической структуры CASV L-Cterm (CASV Xtal) показана над последовательностями. Вторичные структуры, предсказанные Jpred4, показаны под последовательностями. Вторичная структура кристаллической структуры PB2 вируса гриппа (FluA Xtal, PDB ID 5FMM) показана внизу.Выравнивание было проведено с помощью онлайн-инструмента ESPript (http://espript.ibcp.fr) [61] с ручной настройкой.

(TIF)

S3 Рис.
Остатки в белке LASV L, функционально протестированные в системе минирепликонов LASV, выровнены с их предполагаемыми гомологами в других аренавирусах.

Выравнивание идентично выравниванию, представленному на фиг. S2. Остатки в белке L LASV, которые были мутированы и протестированы в системе минирепликонов LASV (методы S1), помечены вместе с их предполагаемыми гомологами в других аренавирусах.Остатки, идентифицированные как важные для транскрипции LASV в этом и предыдущем исследовании [13], выделены оранжевым, в то время как остатки, не играющие специфической роли во время вирусной транскрипции, отмечены серым.

(TIF)

S4 Рис.
Данные минирепликонов для мутантов белка LASV L.

Транскрипционную активность мутантов L-белка измеряли с помощью экспрессии репортерного гена Ren-Luc. Активность Ren-Luc показана на гистограмме (среднее и стандартное отклонение стандартизованных относительных световых единиц [sRLU] в процентах от дикого типа в ≥3 независимых экспериментах по трансфекции).Синтез антигенома и мРНК Ren-Luc оценивали методом Нозерн-блоттинга с использованием радиоактивно меченного рибозонда, гибридизующегося с геном Ren-Luc. Дефектный белок L с мутацией в каталитическом сайте РНК-зависимой РНК-полимеразы служил отрицательным контролем (нег). Сигналы на Нозерн-блоттинге количественно оценивали с помощью профилей интенсивности. Данные также представлены в числовом виде в таблице S2. Окрашенная метиленовым синим 28S рРНК показана как маркер для загрузки геля и переноса РНК. Показан иммуноблот-анализ мутантов белка L с меткой FLAG.Мутанты с фенотипом с дефектом мРНК отмечены звездочкой. Подробные сведения об эксперименте см. В разделе “Методы S1”.

(TIF)

S5 Рис.
Связывание данных репликона LASV со структурой CASV L-Cterm.

Схема ленты конструкции CASV L-Cterm в A) Мушка и B) Мушка . Остатки, которые, как было установлено, важны для вирусной транскрипции в системе минирепликонов LASV в этом и предыдущем исследовании [13] и могут быть локализованы в структуре L-Cterm CASV в соответствии с выравниванием на S3 Fig, показаны как красные палочки. C) Сводка остатков, важных для транскрипции LASV. В таблице далее перечислены предполагаемые эквивалентные остатки в CASV, их расположение в домене 1 или 2 CASV L-Cterm и предложена функция этих остатков в структуре CASV L-Cterm.

(TIF)

S6 Рис.
Анализы связывания с кэпом.

A) Анализ связывания с m 7 GTP-агарозой. На рисунке показаны гели SDS, окрашенные кумасси, включая маркер молекулярной массы (MW).Для каждого протестированного белка гель содержит три дорожки: белок, который будет использоваться для анализа (первая дорожка), фракция, связанная с m 7 GTP-агарозой (вторая дорожка, m 7 GTP), и фракция, связанная с холостым сигналом. агароза в качестве контроля специфичности (третья полоса, контроль). eIF4E и вирус гриппа PB2 использовали в качестве положительного контроля для связывания m 7 GTP-агарозы. CASV L-Cterm (Cterm), L-Cterm домен 2 (домен 2), L-Cterm deltaC (deltaC) и LASV L-Cterm были протестированы при 4 ° C и 20 ° C. B) Анализ связывания с кэпированной РНК. Радиоактивно меченая кэпированная РНК инкубировали либо с вирусом гриппа PB2 (PB2), либо с CASV L-Cterm (Cterm), CASV L-Cterm deltaC (deltaC), доменом 2 CASV L-Cterm (домен 2), L-Cterm LASV (LASV C). или без белка (нег). Свободную РНК и комплексы белок-РНК разделяли в нативном геле и визуализировали с помощью авторадиографии. C) Анализ для проверки связывания РНК независимо от кэп-структуры для CASV L-Cterm deltaC. CASV L-Cterm deltaC (deltaC) инкубировали с различными количествами кэпированной (кэп-РНК) или не кэпированной РНК (РНК) в присутствии радиоактивно меченой некэпированной РНК ( 32 P-РНК).Общее количество РНК оставалось постоянным во всех реакциях. Свободную РНК и комплексы белок-РНК разделяли в нативном геле и визуализировали с помощью авторадиографии.

(TIF)

S7 Рис.
Анализ термостабильности в присутствии m 7 GTP, GTP или ATP.

Температурную стабильность белков CASV L-Cterm, CASV L-Cterm deltaC, домена 2 CASV L-Cterm, PB2 вируса гриппа и L-Cterm LASV измеряли в отсутствие (контроль) и в присутствии 2, 5 и 10 мМ. либо m 7 GTP, GTP или ATP.Представленные кривые показывают относительное увеличение сигнала флуоресценции (связанного с разворачиванием белка) в зависимости от температуры. Разница не менее 3 ° C при уровне флуоресценции 50% (пунктирная линия серого цвета) указывает на значительное изменение термостабильности белка.

(TIF)

S8 Рис.
Сопоставление N-концевых последовательностей аренавируса и PA гриппа.

Выравнивание было произведено с помощью ClustalOmega [31] с ручной настройкой.Он включает последовательности белков L рептаренавирусов CASV (Uniprot-ID: J7HBG8) и аренавируса удавов NL (ROUTV, M4PUV6) и маммаренавирусов LASV ({“type”: “entrez-protein”, “attrs”: {“text”: ” Q6Y630 “,” term_id “:” 75551266 “,” term_text “:” Q6Y630 “}} Q6Y630), вирус Мобала (MOBV, {” type “:” entrez-protein “,” attrs “: {” text “:” Q27YE5 “,” term_id “:” 123827698 “,” term_text “:” Q27YE5 “}} Q27YE5), LCMV ({” type “:” entrez-protein “,” attrs “: {” text “:” P14240 “,” term_id “:” 133636 “,” term_text “:” P14240 “}} P14240), вирус Хунин (JUNV, {” type “:” entrez-protein “,” attrs “: {” text “:” Q6XQI4 “,” term_id ” : “221272067”, “term_text”: “Q6XQI4”}} Q6XQI4), вирус Tacaribe (TACV, {“type”: “entrez-protein”, “attrs”: {“text”: “P20430”, “term_id”: “133654”, “term_text”: “P20430”}} P20430) и вирус Oliveros (OLVV, {“type”: “entrez-protein”, “attrs”: {“text”: “Q6XQH7”, “term_id”: ” 221272066 “,” term_text “:” Q6XQH7 “}} Q6XQH7), а также последовательность PA вируса гриппа A (FluA, {” type “:” entrez-protein “,” attrs “: {” text “:” P31343 ” , “term_id”: “401028”, “term_text”: “P31343”}} P3134 3).Ключевые остатки активного сайта эндонуклеазы отмечены красными треугольниками. Вторичная структура кристаллической структуры эндонуклеазы CASV (CASV Xtal) показана над последовательностями. Вторичные структуры, предсказанные Jpred4 [60], показаны под последовательностями. Вторичная структура кристаллической структуры PA вируса гриппа (FluA Xtal, PDB ID 2W69) показана внизу. Выравнивание было проведено с помощью онлайн-инструмента ESPript (http://espript.ibcp.fr) [61] с ручной настройкой.

(TIF)

S9 Рис.
Анализ эндонуклеаз для CASV Endo.

Активность эндонуклеазы CASV была протестирована в нашем ранее опубликованном анализе радиоактивных эндонуклеаз (методы S1) [17]. 32 P-меченные субстраты оцРНК полиА двух различных длин (27 и 40 нуклеотидов) инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C либо в присутствии, либо в отсутствие 5 мМ Mn 2+ с каталитически активной мутантной эндонуклеазой вируса Анд ( ANDV Endo K44A ), каталитически неактивный мутант эндонуклеазы Андского вируса (ANDV Endo h46R ) или фрагмент эндонуклеазы CASV (CASV Endo).Субстраты и продукты реакции разделяли в денатурирующем полиакриламидном геле и визуализировали с помощью авторадиографии.

(TIF)

S10 Рис.
Электростатический поверхностный потенциал CASV L-Cterm.

Участки кислотных и основных аминокислот от С-конца, которые сцепляются друг с другом в димере белка, отмечены пунктирными кружками. Электростатический поверхностный потенциал показан от -5 кТ / э красным цветом до +5 кТ / э синим и был рассчитан с использованием PDB2PQR и APBS-инструмента PyMOL.

(TIF)

S11 Рис.
Сравнение N-концевых последовательностей L белков и PA.

A) Матрица идентичности и B) матрица сходства N-концевых последовательностей. Матрицы были рассчитаны на основе представленного выравнивания N-концов (S8 Fig) с использованием онлайн-инструмента SIAS (http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html), а значения даны в процентах относительно среднего длина сравниваемых последовательностей. Сокращения: Полные названия вирусов приведены в легенде к S8 Fig.

(TIF)

S12 Рис.
Сравнение С-концевых последовательностей белков L и PB2.

A) Матрица идентичности и B) матрица сходства C-концевых последовательностей. Матрицы были рассчитаны на основе представленного выравнивания С-концов (S2 рис.) С использованием онлайн-инструмента SIAS (http://imed.med.ucm.es/Tools/sias.html), а значения даны в процентах относительно среднего длина сравниваемых последовательностей. Сокращения: Полные названия вирусов приведены в легенде к S2 Рис.

(TIF)

S13 Рис.
Выравнивание N-концевых последовательностей рептаренавируса.

Выравнивание было произведено с использованием ClustalOmega [31] и включает последовательности белков L рептаренавирусов CASV (Uniprot-ID: J7HBG8), аренавируса удавов NL (ROUTV, M4PUV6), а также 13 последовательностей других белков L рептаренавируса (Uniprot-IDs являются данный). Вторичная структура кристаллической структуры эндонуклеазы CASV (CASV Xtal) показана над последовательностями. Выравнивание было проведено с помощью онлайн-инструмента ESPript (http: // espript.ibcp.fr) [61].

(TIF)

S14 Рис.
Выравнивание С-концевых последовательностей рептаренавируса.

Выравнивание было произведено с использованием ClustalOmega [31] и включает последовательности белков L рептаренавирусов CASV (Uniprot-ID: J7HBG8), аренавируса удавов NL (ROUTV, M4PUV6), а также 13 последовательностей других белков L рептаренавируса (Uniprot-IDs являются данный). Вторичная структура кристаллической структуры CASV L-Cterm (CASV Xtal) показана над последовательностями. Выравнивание было проведено с помощью онлайн-инструмента ESPript (http: // espript.ibcp.fr) [61] с ручной настройкой.

(TIF)

S1 Таблица
Кристаллографические данные и статистика уточнения.

(DOC)

S2 Таблица
Анализ мутантов белка L в системе репликонов вируса Ласса.

(DOC)

S3 Таблица
Список протестированных L-протеиновых C-концевых фрагментов.

Этот список содержит протестированные фрагменты, которые были либо нерастворимы, не подходили для испытаний по кристаллизации, либо не могли быть успешно кристаллизованы.

(DOC)

S1 Methods
Подробное описание экспериментов с минирепликоном LASV и анализа эндонуклеаз.

Подробно описаны методы системы минирепликонов LASV и эндонуклеазного анализа.

(DOC)

История, Джеймс Глейк

Вы слышали о вечеринке для путешественников во времени? Стивен Хокинг разослал приглашения постфактум, а затем стал ждать. И ждал, и ждал, потому что никто никогда не появлялся.

Это одна из любимых шуток Хокинга.Это также проблеск юмора, науки и диковинных возможностей путешествий во времени, лежащих в основе последней книги Джеймса Глейка. Глейк известен тем, что занимается серьезными физическими темами, такими как теория хаоса и информатика, но его последнее предприятие добавляет в эту смесь немного беззаботности.

В отличие от других превосходных популярных трактовок физики времени, таких как работа Шона Кэрролла From Eternity to Here или собственная A Brief History of Time Хокинга, Глейк уделяет особое внимание научным и поп-культурным последствиям путешествий по миру. время.Давайте уберем спойлеры: путешествие во времени невозможно. Но просто подумать о концепции – это увлекательное приключение.

Глейк открывает самый известный рассказ о путешествиях во времени, опубликованный как The Time Machine Гербертом Уэллсом в 1895 году. Это была первая попытка исследовать возможности перехода между эпохами, как вперед, так и назад в потоке. время. Уэллс не был философом или ученым; он изобрел теоретическое механическое устройство с единственной целью развлечь своих читателей.

И все же разум его писателя сумел уловить большую часть сущности путешествий во времени в понимании физики 21-го века: время – это дополнительное измерение поверх трех измерений пространства. Возвращение в прошлое может серьезно повлиять на историю (просто спросите Терминатора). Если вы зайдете слишком далеко в будущее, вы окажетесь на краю света, и это будет мрачно.

Как и большая часть научной фантастики, путешествия во времени дают возможность исследовать более широкие социальные проблемы.Марк Твен бросил своего коннектикутского янки при дворе короля Артура, чтобы высмеять представления о рыцарстве. Роберт Хайнлайн отправил главного героя через Врата времени, чтобы выяснить, что происходит, когда встречаются пять итераций одного и того же человека. Билл Мюррей получал один шанс за другим искупить свою вину, поскольку его сварливый метеоролог из Пенсильвании каждый день просыпается и обнаруживает, что это все еще День сурка. Глейк проходит через множество Doctor Who и на удивление мало Star Trek .

«Путешествие во времени: история» Джеймса Глейка

Появляются и другие писательские повествования.Материализуются чувственные и накладывающиеся друг на друга сцены памяти Марселя Пруста, как и лабиринтные зарисовки вилок во времени Хорхе Луиса Борхеса. Том Стоппард Arcadia размышляет о природе энтропии, поскольку Вселенная распадается с течением времени.

Философия и физика переплетаются с художественной литературой. От истоков фатализма до уроков термодинамики все может быть немного ошеломляющим. Глейк рикошетит от концепции к концепции, рассчитывая на то, что его плавный текст поможет воплотить передовые концепции.Он повсюду отбрасывает эрудированные ссылки; в какой-то момент он размышляет о том, сможет ли путешественник во времени избавить кошку Шредингера (которая, как известно, не была мертвой и не живой в квантовом мире, пока ее не наблюдали) из ее страданий раз и навсегда. Даже необычный дизайн обложки книги – умный намек на эксперименты по квантовой оптике.

Одни из самых тяжелых событий приходится на разделы, посвященные смертности. В конце концов, цель путешествия во времени – избежать собственной смерти. В короткометражном фильме 1962 года « La Jeteé » ( The Jetty ) запечатлен мужчина, переживший пытки, только для того, чтобы снова и снова возвращаться к сцене из своего прошлого, с загадочной женщиной и смертью, которая не раскрывается до последних шокирующих моментов.

Иногда Глейк дает читателю передышку. Погружение в историю капсул времени – это восхитительная медитация на природу того, что общество считает важным в ту или иную эпоху. А принятие часовых поясов, необходимое, когда железные дороги начали охватывать континенты, обеспечило конкретное объединение трех измерений пространства и измерения времени (потому что поезд должен был приходить в Омаху в определенное время каждый день).

Путешествие во времени охватывает так много полей, что требовать большего кажется нелогичным.Но еще несколько незападных взглядов, таких как представления австралийских аборигенов о времени сновидений, были бы желательны.

Возможно, лучший способ испытать Путешествие во времени – это, как и в любой плотной книге: перелистывать ее страницы вперед и назад, копаться на какое-то время, а затем дать ей отдохнуть. Это сама по себе версия путешествия во времени, способ пропустить течение повествования, даже если течение времени беспрерывно уносит нас вперед, в будущее.

Александра Витце – научный журналист из Боулдера, штат Колорадо.- дом атомных часов, которые устанавливают официальное время в Соединенных Штатах и ​​не допускают путешествий во времени.

Путешествие во времени: история

Джеймс Глейк

(Пантеон, 27,95 долларов)

Подробнее

«Остров в огне» Александры Витце и Джеффа Канипе

Структурная модель для полного Цикл транскрипции полимеразы гриппа

Основные моменты

Крио-ЭМ снимки элонгации, терминации и повторного использования транскрипции

После копирования 3′-конец шаблона повторно связывает полимеразу вторичный сайт

Выяснен механизм образования поли (A) хвоста вирусной мРНК путем заикания

Эффективное реформирование промотора позволяет использовать множественные транскрипты из одной РНП

Сводная информация

. уникальные механизмы для синтеза кэпированных и полиаденилированных мРНК из геномной вирусной РНК (вРНК) te mplate, который упакован внутри частиц рибонуклеопротеина (vRNP).Здесь мы визуализируем с помощью криоэлектронной микроскопии конформационную динамику полимеразы во время полного цикла транскрипции от предварительной инициации до терминации, уделяя особое внимание траектории матрицы. После выхода из полости активного сайта 3′-конец шаблона повторно присоединяется к конкретному сайту на поверхности полимеразы. Здесь он остается секвестрированным во время всех последующих этапов транскрипции, заставляя шаблон выходить из петли при дальнейшей транслокации. При терминации напряженная связь между связанным 5′-концом матрицы и активным сайтом приводит к полиаденилированию за счет заикания по уридину 17.После диссоциации продукта дальнейшие конформационные изменения высвобождают захваченный шаблон, позволяя вернуться в исходное состояние. Таким образом, полимераза гриппа выполняет транскрипцию, плотно связываясь и защищая оба конца матрицы, что позволяет эффективно продуцировать множество мРНК из одной vRNP.

Ключевые слова

Вирус гриппа

РНК-зависимая РНК-полимераза

транскрипция

захват кепки

полиаденилирование

вторичный 3 ‘

сайт концевого связывания

крио-электронная микроскопия 9000 статей )

© 2020 Elsevier Inc.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Единичная мутация PA как детерминанта вакцины против гриппа с высоким выходом

  • 1

    Вебстер Р.Г. и Говоркова Е.А. Продолжающиеся проблемы с гриппом. Анналы Нью-Йоркской академии наук 1323 , 115–139, DOI: 10.1111 / nyas.12462 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 2

    Херфст, С., Имаи, М., Каваока, Ю.И Фушье, Р. А. Передача вируса птичьего гриппа млекопитающим. Актуальные темы микробиологии и иммунологии 385 , 137–155, DOI: 10.1007 / 82_2014_387 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 3

    Neumann, G. & Kawaoka, Y. Передача вирусов гриппа А. Вирусология 479–480C , 234–246, DOI: 10.1016 / j.virol.2015.03.009 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 4

    Фрейдл, Г.S. et al. Грипп на стыке животных и человека: обзор литературы по вирусологическим свидетельствам инфицирования человека вирусами свиного или птичьего гриппа, отличными от A (H5N1). Надзор в Европе: бюллетень European Sur les Maladies Transmissions = Европейский бюллетень по инфекционным болезням 19 (2014).

  • 5

    ВОЗ. (Всемирная организация здравоохранения, 2015 г.).

  • 6

    ВОЗ. Оценка ВОЗ риска заражения людей вирусом птичьего гриппа A (H7N9) (опубликовано 23 февраля 2015 г .; оценка проведена через http: // www.who.int/influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/RiskAssessment_H7N9_23Feb20115.pdf). (2015).

  • 7

    Herfst, S. et al. Передача вируса гриппа A / H5N1 воздушно-капельным путем между хорьками. Science 336 , 1534–1541, DOI: 336/6088/1534 [pii] 10.1126 / science.1213362 (2012).

    Артикул Google Scholar

  • 8

    Imai, M. et al. Экспериментальная адаптация НА гриппа H5 вызывает респираторно-капельную передачу реассортантному вирусу H5 HA / h2N1 у хорьков. Nature 486 , 420–428, DOI: 10,1038 / nature10831 (2012).

    Артикул Google Scholar

  • 9

    Шульц-Черри, С. и Джонс, Дж. К. Противогриппозные вакцины: хорошие, плохие и яйца. Достижения в вирусных исследованиях 77 , 63–84, DOI: 10.1016 / B978-0-12-385034-8.00003-X (2010).

    Артикул Google Scholar

  • 10

    Уэбби, Р.J. et al. Реагирование на предупреждение о пандемии: использование обратной генетики для быстрой разработки противогриппозных вакцин. Ланцет 363 , 1099–1103, DOI: 10.1016 / S0140-6736 (04) 15892-3 (2004).

    Артикул Google Scholar

  • 11

    Baz, M., Luke, C.J., Cheng, X., Jin, H. & Subbarao, K. Вакцины против H5N1 для человека. Исследование вирусов 178 , 78–98, DOI: 10.1016 / j.virusres.2013.05.006 (2013).

    Артикул Google Scholar

  • 12

    Милиан, Э. и Камен, А. А. Текущие и новые технологии производства клеточных культур для противогриппозных вакцин. Международное исследование BioMed 2015 , 504831, DOI: 10.1155 / 2015/504831 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 13

    Лу, Б., Чжоу, Х., Йе, Д., Кембл, Г. и Джин, Х. Улучшение роста вируса гриппа A / Fujian / 411/02 (h4N2) в куриных яйцах с эмбрионами путем уравновешивания активности гемагглютинина и нейраминидазы с использованием обратной генетики. Журнал вирусологии 79 , 6763–6771, DOI: 10.1128 / JVI.79.11.6763-6771.2005 (2005).

    Артикул Google Scholar

  • 14

    Робертсон, Дж. С. и др. Разработка вакцинных вирусов против пандемического гриппа A (h2N1). Vaccine 29 , 1836–1843, DOI: 10.1016 / j.vaccine.2010.12.044 (2011).

    Артикул Google Scholar

  • 15

    Del Giudice, G.И Раппуоли, Р. Инактивированные и адъювантные вакцины против гриппа. Curr Top Microbiol Immunol 386 , 151–180, DOI: 10.1007 / 82_2014_406 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 16

    Канг, С. М., Пушко, П., Брайт, Р. А., Смит, Г. и Компанс, Р. В. Гриппоподобные частицы в качестве пандемических вакцин. Curr Top Microbiol Immunol 333 , 269–289, DOI: 10.1007 / 978-3-540-92165-3_14 (2009).

    Артикул Google Scholar

  • 17

    Perdue, M. L. et al. Будущее производства противогриппозной вакцины на основе клеточных культур. Экспертный обзор вакцин 10 , 1183–1194, DOI: 10.1586 / erv.11.82 (2011).

    Артикул Google Scholar

  • 18

    Ли И., Ким Дж. И. и Парк М.С. Вакцины против гриппа на основе клеточных культур в качестве альтернативы вакцинам на основе яиц. Журнал бактериологии и вирусологии 43 , 9–17 (2013).

    Артикул Google Scholar

  • 19

    Говоркова Е. А., Кодихалли С., Алымова И. В., Фангет Б. и Вебстер Р. Г. Рост и иммуногенность вирусов гриппа, культивируемых в клетках Vero или MDCK и в куриных яйцах с эмбрионами. Развитие биологической стандартизации 98 , 39–51; обсуждение 73-34 (1999).

    Google Scholar

  • 20

    Кистнер, О.и другие. Вакцина из цельного вируса (H5N1), полученная из культуры клеток (Vero), на основе штамма вируса дикого типа вызывает перекрестные защитные иммунные ответы. Вакцина 25 , 6028–6036, DOI: 10.1016 / j.vaccine.2007.05.013 (2007).

    Артикул Google Scholar

  • 21

    Видор, Э., Мешиевич, С. и Плоткин, С. Пятнадцатилетний опыт работы с инактивированной полиовирусной вакциной повышенной эффективности, производимой Vero. Журнал детских инфекционных болезней 16 , 312–322 (1997).

    Артикул Google Scholar

  • 22

    Барретт П. Н., Мундт В., Кистнер О. и Ховард М. К. Платформа клеток Vero в производстве вакцин: переход к вирусным вакцинам на основе клеточных культур. Экспертный обзор вакцин 8 , 607–618, DOI: 10.1586 / erv.09.19 (2009).

    Артикул Google Scholar

  • 23

    Николсон, К., Майор, Д., Вуд, Дж. М.И Робертсон, Дж. С. Генерация вирусов гриппа для вакцины на клетках Vero с помощью обратной генетики: штамм вакцины-кандидата H5N1, произведенный в рамках системы качества. Vaccine 23 , 2943–2952, DOI: 10.1016 / j.vaccine.2004.08.054 (2005).

    Артикул Google Scholar

  • 24

    Murakami, S. et al. Усиленный рост вирусов семян вакцины против гриппа в клетках vero, опосредованный расширением оптимального диапазона pH для слияния вирусных мембран. Журнал вирусологии 86 , 1405–1410, DOI: 10.1128 / JVI.06009-11 (2012).

    Артикул Google Scholar

  • 25

    Tseng, Y. F. et al. Адаптация быстрорастущего вируса вакцины против гриппа H5N1 в клетках Vero: последствия для готовности к пандемии. PloS one 6 , e24057, DOI: 10.1371 / journal.pone.0024057 (2011).

    Артикул Google Scholar

  • 26

    Хаузер, К.И Суббарао, К. Вакцины против гриппа: проблемы и решения. Клетка-хозяин и микроб 17 , 295–300, DOI: 10.1016 / j.chom.2015.02.012 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 27

    Шоу, М. Л. и Палезе, П. В Fields Virology 1151–1185 (Lippincott Williams & Wilkins, 2013).

  • 28

    Lam, T. T. et al. Распространение, дивергенция и установление вирусов гриппа H7N9 в Китае. Nature 522 , 102–105, DOI: 10,1038 / nature14348 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 29

    Yamaji, R. et al. Адаптивные мутации у млекопитающих белка PA высокопатогенного вируса птичьего гриппа H5N1. Журнал вирусологии 89 , 4117–4125, DOI: 10.1128 / JVI.03532-14 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 30

    Диас, А.и другие. Эндонуклеаза полимеразы вируса гриппа, захватывающая кепку, находится в субъединице PA. Nature 458 , 914–918, DOI: 10.1038 / nature07745 (2009).

    Артикул Google Scholar

  • 31

    Xiao, S. et al. Связывание магний-зависимой РНК с РА-эндонуклеазным доменом полимеразы птичьего гриппа. J Phys Chem B 118 , 873–889, DOI: 10,1021 / jp408383g (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 32

    Арай, Ю.и другие. Новые мутации гена полимеразы для адаптации человека в клинических изолятах вирусов птичьего гриппа H5N1. Патогены PLoS 12 , e1005583, DOI: 10.1371 / journal.ppat.1005583 (2016).

    Артикул Google Scholar

  • 33

    Zhu, W., Zou, X., Zhou, J., Tang, J. & Shu, Y. Остатки 41V и / или 210D в белке NP усиливают полимеразную активность и потенциальную репликацию нового гриппа (H7N9 ) вирусы при низкой температуре. Журнал вирусологии 12 , 71, DOI: 10.1186 / s12985-015-0304-6 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 34

    Хаяси, Т., Уиллс, С., Бусси, К. А. и Такимото, Т. Идентификация остатков вируса гриппа А PB2, участвующих в повышенной активности полимеразы и росте вируса в клетках млекопитающих при низких температурах. Журнал вирусологии 89 , 8042–8049, DOI: 10.1128 / JVI.00901-15 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 35

    Tan, L. et al. Комбинация мутаций HA и PA увеличивает вирулентность адаптированного к мышам вируса гриппа A H6N6. Журнал вирусологии 88 , 14116–14125, DOI: 10.1128 / JVI.01736-14 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 36

    Le, J. et al. Разработка высокопродуктивных реассортантов вирусов гриппа типа B и анализ их генного состава. Vaccine 33 , 879–884, DOI: 10.1016 / j.vaccine.2014.12.027 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 37

    Плант, Э. П. и Йе, З. Констелляция химерной нейраминидазы и мутантного гена PB1 улучшает рост и выход вируса-кандидата на вакцину H5N1. Журнал общей вирусологии 96 , 752–755, DOI: 10.1099 / jgv.0.000025 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 38

    Гарсия-Састре, А.и другие. Вирус гриппа A, лишенный гена NS1, реплицируется в интерферон-дефицитных системах. Вирусология 252 , 324–330 (1998).

    Артикул Google Scholar

  • 39

    Seitz, C., Frensing, T., Hoper, D., Kochs, G. & Reichl, U. Высокому выходу вируса гриппа A в клетках почек собак Madin-Darby способствует недостаточное количество индуцированного интерфероном противовирусное состояние. Журнал общей вирусологии 91 , 1754–1763, DOI: 10.1099 / vir.0.020370-0 (2010).

    Артикул Google Scholar

  • 40

    Ping, J. et al. Разработка высокоурожайных вакцин против вируса гриппа А. Нац Коммуна 6 , 8148, DOI: 10,1038 / ncomms9148 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 41

    Ким, Дж. И. и Парк, М. С. N-связанное гликозилирование в гемагглютинине вирусов гриппа А. Yonsei Med J 53 , 886–893, DOI: 10.3349 / ymj.2012.53.5.886 (2012).

    Артикул Google Scholar

  • 42

    Kim, J. I. et al. Генетическая потребность в гликозилировании гемагглютинина и его значение для эволюции вируса гриппа A h2N1. Журнал вирусологии 87 , 7539–7549, DOI: 10.1128 / JVI.00373-13 (2013).

    Артикул Google Scholar

  • 43

    Tate, M. D. et al. Игра в прятки: как гликозилирование гемагглютинина вируса гриппа может модулировать иммунный ответ на инфекцию. Вирусы 6 , 1294–1316, DOI: 10.3390 / v6031294 (2014).

    Артикул Google Scholar

  • 44

    Zhang, X. et al. Гликозилирование гемагглютинина модулирует патогенность и антигенность вируса птичьего гриппа H5N1. Ветеринарная микробиология 175 , 244–256, DOI: 10.1016 / j.vetmic.2014.12.011 (2015).

    Артикул Google Scholar

  • 45

    Фодор, Э.и другие. Спасение вируса гриппа А от рекомбинантной ДНК. Журнал вирусологии 73 , 9679–9682 (1999).

    Google Scholar

  • 46

    Carcelli, M. et al. N-ацилгидразоновые ингибиторы эндонуклеазы PA вируса гриппа с универсальными способами связывания металлов. Sci Rep 6 , 31500, DOI: 10,1038 / srep31500 (2016).

    Артикул Google Scholar

  • 47

    PyMOL.Система молекулярной графики PyMOL, версия 1.8 Schrodinger, LLC (https://www.pymol.org/).

  • Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, используйте кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    К более прагматическому взгляду на доказательства

    230 СТИВЕН ГИМБЕЛ

    ПРИМЕЧАНИЯ

    1 Хотя Ахинштейн не утверждает, что kof (3) должен быть равен kof (4), приведенный выше аргумент

    для k> 1

    2 в случае (3), может быть воспроизведен для условия (4), поскольку необходимая исключительность

    гарантируется для объясняющего соединения, поскольку соединение

    требует вероятности, превышающей k для правильного объяснения.

    2Ахинштейн подходит к подобным случаям, утверждая, что у нас нет доказательств, но есть потенциальные доказательства для рассматриваемой гипотезы, то есть доказательства того, что гипотеза

    esis может быть верной. Таким образом, он может признать, что случай, подобный этому, действительно составляет

    свидетельств, не изменяя своего определения – у нас просто есть свидетельства для другой, более слабой гипотезы

    . Хотя утверждение, что это утверждение является свидетельством – что другое утверждение

    верно, может быть правильным, остается открытой возможностью, что оно является свидетельством – исходной гипотезы.

    3Это утверждение аналогично тому, что было сделано у Джеффри (1969), где утверждается, что статистическое планирование ex-

    имеет «как статистический, так и причинный компонент». Однако здесь утверждается

    , что свидетельство имеет статистический и объяснительный (часто причинный) компонент.

    4 Утверждение здесь не в том, что спецификация какого-либо аспекта причинной структуры необходима

    для доказательства. В квантово-механических случаях, например, определенные утверждения о

    ложном причинном механизме могут быть бессмысленными или ложными, но это не противоречит сделанному здесь выводу

    .Хотя бессмысленные утверждения не являются доказательством какого-либо утверждения, в других научных контекстах утверждения о лежащей в основе причинной структуре имеют значение,

    , и в таких случаях они могут подтверждать гипотезу, несмотря на статистическую несоответствие.

    ССЫЛКИ

    Achinstein, P .: 1981, «On Evidence: A Response to Bar-Hillel and Margalit», Mind, 90.

    Ахинштейн, П .: 1983a, Природа объяснения, Oxford University Press, Нью-Йорк.

    Ахинштейн, П.: 1983b, «Concepts of Evidence», in The Concept of Evidence, P. Achinstein

    (ed.), Oxford University Press, Нью-Йорк.

    Ахинштейн, П .: 1992, «Свидетельства против Кронца», Философские исследования, 67.

    Ахинштейн, П .: 1996, «Плавание в доказательствах: ответ Махеру», Философия науки,

    63.

    Бар-Гиллель, М. и А. Маргалит: 1979, «Защита классической концепции Evidence », Mind,

    88.

    Brush, Steven: 1989,« Prediction and Theory Evaluation: The Case of Light Bending »,

    Science, 246.

    Карнап, Р .: 1962, Логические основы вероятности (2-е издание), Чикагский университет

    Press, Чикаго.

    Эрвин, Э. и Х. Сигель: 1989, «Различны ли подтверждения?», British Journal for the

    Philosophy of Science, 40.

    Глюк, С. и С. Гимбел: 1997, «Контрпример второстепенной причины к модели объяснения DNP

    Рейлтона», Философия науки, 64.

    Оставить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *